System promotora T7

• Co to jest sekwencja promotora T7?
• Cechy systemu ekspresji plazmidu T7
• Technologia znaczników MAT™
• Przewodnik po systemie promotora i ekspresji T7

 Co to jest  Sekwencja promotora T7?

Promotor T7 to sekwencja DNA o długości 18 par zasad do miejsca rozpoczęcia transkrypcji w +1 (5' - TAATACGACTCACTATAG - 3'), która jest rozpoznawana przez polimerazę RNA T7¹ . Promotor T7 jest powszechnie stosowany do regulacji ekspresji genów rekombinowanych białek, które mogą być następnie wykorzystywane do różnych dalszych zastosowań badawczych².

 Cechy systemu ekspresji plazmidów T7

Bakteryjne wektory oparte na promotorze T7 umożliwiają ekspresję, wykrywanie i oczyszczanie rekombinowanych fuzji FLAG^® i MAT™ (Metal Affinity Tag) w E. coli. Kilka wektorów zawierających promotor T7 oferuje opcje podwójnego znakowania dla białek fuzyjnych znakowanych FLAG^® i MAT™. Wektory te nadają oporność na ampicylinę w celu łatwej selekcji pozytywnych transformantów. Dodatkowo wektory zawierają terminator transkrypcji T1T2, źródło replikacji pMB1 (pochodna pBR322), źródło f1 i gen lacI do represji promotora T7.

wektory pT7-FLAG^® i pT7-MAT™ oferują bardzo silny promotor T7/lac. Te wektory ekspresyjne zapewniają jeszcze wyższą wydajność rekombinowanego białka niż system promotora tac. Jednak promotor T7 jest znany z ekspresji w tle ("leaky"), co może być wadą, gdy rekombinowane białka są toksyczne dla komórki gospodarza. Dlatego nasze wektory zawierają sekwencje operatora lac (lacO) bezpośrednio za promotorem, aby zmniejszyć nieszczelną ekspresję. W przeciwieństwie do systemu promotora tac, wektory pT7 muszą być wyrażane w gospodarzach zawierających źródło polimerazy T7, takich jak szczepy lizogeniczne (DE3).

 Technologia tagów MAT™

Znacznik MAT™ lub Metal Affinity Tag (HNHRHKH) został stworzony do oczyszczania rekombinowanych białek fuzyjnych MAT™ przy użyciu żeli powinowactwa niklowego i kobaltowego HIS-Select. Produkty HIS-Select pozwalają na wysoce selektywne oczyszczanie białek fuzyjnych znakowanych histydyną, takich jak fuzje MAT™. Wiele z naszych najnowszych wektorów wykorzystuje znacznik MAT™, często w połączeniu z dobrze znanym znacznikiem FLAG^® tag. Wektory zawierające znacznik MAT™ są oferowane w formatach do znakowania N-terminalnego lub C-terminalnego.

Rysunek 1. Gen kanamycyny i gen ampicyliny dla większej elastyczności selekcji w E. coli

Referencje

1. Rong M, He B, McAllister WT, Durbin RK. 1998. Promoter specificity determinants of T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95(2):515-519. https://doi.org/10.1073/pnas.95.2.515

2. Komura R, Aoki W, Motone K, Satomura A, Ueda M. High-throughput evaluation of T7 promoter variants using biased randomization and DNA barcoding. PLoS ONE. 13(5):e0196905. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196905