Klonowanie interesujących genów do wektora plazmidowego

Oxford Genetics

• Wybór systemu klonowania i wektora plazmidowego
• Trawienie restrykcyjne plazmidu
• Trawienie restrykcyjne fragmentu
• Usuwanie fragmentów z żelu
• Usuwanie fragmentów z żelu
• Annealing DNA Oligos for Ligation
• Adding 5' Phosphates to DNA
• Defosforylowanie DNA
• Przygotowanie DNA do klonowania Bunt-ended
• Ligating the DNA to yield a plasmid containing the Gene-of-Interest
• Site-Directed Mutagenesis

 

Wybór systemu klonowania i wektora plazmidowego

Inżynieria genetyczna jest wykorzystywana w tysiącach laboratoriów na całym świecie. Biorąc pod uwagę jej znaczenie, niezwykłe jest to, że strategie klonowania wielu popularnych składników DNA nie są znormalizowane. Do tego braku standaryzacji przyczynia się wiele dostępnych opcji zestawów do klonowania i innowacyjnych technologii.  Nie zawsze konieczne jest stosowanie zestawu IP- heavy, ponieważ tradycyjne klonowanie przez trawienie enzymami restrykcyjnymi jest jeszcze łatwiejsze dzięki standaryzowanym plazmidom z Oxford Genetics.

Celem Oxford Genetics było zaprojektowanie systemu plazmidów DNA, który mógłby pomieścić większość funkcjonalnych wstawek DNA, których badacz może potrzebować w jednym plazmidzie. Poprzez optymalizację naszego wektora startowego, każdy komponent DNA naszego systemu może zostać usunięty i wymieniony na setki innych sekcji DNA, które zostały przez nas wstępnie zaprojektowane i przetestowane. Jest to koncepcja SnapFast™ concept. Wszystkie nasze konstrukty zostały wstępnie sprawdzone pod kątem słabego wykorzystania kodonów i sprzecznych miejsc restrykcji. Tam, gdzie to możliwe, rzadkie kodony i miejsca restrykcji zostały usunięte, aby umożliwić wydajną ekspresję i zapewnić, że miejsca restrykcji nie ograniczają klonowania innych odcinków DNA SnapFast.

Posiadamy jedną z największych kolekcji plazmidów dostępnych na całym świecie, zapewniając wiele opcji ekspresji i klonowania dla prawie każdej dostarczanej przez nas wstawki. Nasz asortyment produktów obejmuje:

• Największy zakres znaczników peptydowych w dowolnym miejscu (26)
• Łącznie 9 genów reporterowych w 5 konfiguracjach
• Ponad 20 peptydów sygnałowych
• Ponad 40 promotorów do ekspresji u ssaków, bakterii i drożdży
• Łącznie 10 opcji wyboru antybiotyków i metabolizmu

Zalety systemu SnapFast

• Wszystkie plazmidy są kompatybilne ze standardowym klonowaniem, LIC, InFusionHD, Gibson Assembly, Seamless Geneart.
• Dostępnych i kompatybilnych jest ponad 1600 unikalnych sekcji DNA.
• Łatwe, wydajne i proste strategie inżynieryjne.
• Wysoki wskaźnik sukcesu dzięki wstępnie zaprojektowanej kompatybilności.
• Brak ograniczeń rozmiaru wstawki. Niskie pochodzenie kopii dla zwiększenia stabilności.
• Kompatybilność z wieloma istniejącymi wektorami do klonowania i szeregiem wektorów wahadłowych w celu ułatwienia transferu genów.
• Łatwe klonowanie z wektorów SnapFast do szeregu alternatywnych systemów, w tym wektorów wirusowych.
• Wbudowane sekwencje regulacyjne i możliwości (np. konkatameryzacja genów, izolatory i sekwencje terminatora).

Feature	SnapFast	Gateway	TOPO	Gibson	LIC	InFusionHD	Electra
Projektowanie strategii klonowania	Łatwe	Średnie	Łatwe	Trudne*	Trudne*	Trudne*	Trudne*
.Bezproblemowa fuzja z tagami	Tak	Nie	Nie	Tak	Tak	tak	tak
Metody klonowania opatentowane	Nie	Tak	Tak	Tak	Nie	Tak	Tak
Licencja wymagana do badań komercyjnych	Nie	Tak**	Tak**	Nie	Nie	Nie	Nie
Liczba plazmidów	>1650	<100	<20	N/A	N/A	N/A	<200
Koszt	$	$$	$$	$	$	$	$
Unikalne pozycje klonowania w każdym plazmidzie	>20	1	1	N/A	N/A	N/A	1
Wektory wejścia wymagane	Nie	Tak	Tak	Nie	Nie	Nie	Tak
Powiązane w jeden system klonowania?	Nie	Tak	Tak	Nie	Nie	Nie	Tak
Sekwencjonowanie Primery	20 - pełne pokrycie	2	2	N/A	N/A	N/A	None
Sekwencje udostępnione online	Tak	Tak	Tak	N/A	Nie dotyczy	N/A	Nie

* Wymaga projektowania starterów przy użyciu miejsc homologicznych lub TypeIIS
** Patenty ograniczają wykorzystanie technologii klonowania lub produktów
^ Narzędzia dostępne online, aby pomóc w projektowaniu
LIC = klonowanie niezależne od ligazy

Trawienie restrykcyjne plazmidu

Trawienie przygotowawcze to cięcie DNA w celu przygotowania go do ligacji z innym fragmentem DNA, a nie tylko w celu potwierdzenia tożsamości DNA. Należy dążyć do jednoczesnego trawienia zarówno fragmentu, jak i wektora. Pozwoli to zaoszczędzić czas. Ten protokół zakłada roztwór plazmidu w Tris-EDTA (TE) lub buforze elucyjnym (EB) lub wolnym od nukleazy H₂O, który wynosi 200-300 ng/µL i około 3-5 kb. Większe plazmidy mogą wymagać użycia większej objętości, ponieważ przy tym samym stężeniu będzie mniej kopii plazmidu.

W tym konkretnym przykładzie można wykonać następujące czynności:

10-20 µL plazmidu (200-300 ng/μL, całkowita ilość 3-5 µg)
10 µL 10X buforu restrykcyjnego
10 µL z 10X albuminy surowicy bydlęcej  (BSA, końcowe stężenie wynosi zwykle 100 µg/ml) (Nr kat. A7906)
1,5-2 µL enzymu restrykcyjnego 1 (10-20 jednostek/µL)
1.5-2 µL enzymu restrykcyjnego 2 (opcjonalnie)
Uzupełnić do 70 lub 100 µL całkowitej objętości z TE  (Nr kat. T9285) lub wody wolnej od nukleazy (Nr kat. W4502)

Umieść powyższe odczynniki w sterylnym 1,5 ml naczyniu Eppendorf, najpierw dodaj TE lub wodę, następnie plazmid/DNA, następnie bufor restrykcyjny i BSA i dokładnie wymieszaj. Na koniec dodaj enzym(y) restrykcyjny(e). Wybrane enzymy restrykcyjne zależą od celów i mapy plazmidu, ale mogą obejmować EcoR I, BamH I lub Hind III. Inkubuj reakcję w odpowiedniej temperaturze (zwykle 37 °C, ale zawsze upewnij się, że nie masz do czynienia z wyjątkiem, takim jak SwaI w 25 °C) i uruchom budzik (odliczaj w górę). Uruchom reakcję na 40-60 minut. Teraz można usunąć fosforylację wektora za pomocą fosfatazy alkalicznej (CIP). Możesz chcieć dezaktywować enzymy restrykcyjne w tym momencie, jest to standardowa praktyka.

Przeprowadź trawienie na żelu agarozowym (z bardzo dużą studzienką do załadowania dużej próbki) i sprawdź wyniki pod kątem pojedynczego pasma o wielkości zlinearyzowanego plazmidu. Istnieją trzy możliwe wyniki tego trawienia:

• w ogóle nie zadziałało. Nie ma sensu dłużej trawić, ponieważ reakcja nie powiodła się. Jeśli enzym działał wcześniej na innym plazmidzie, być może ponownie wytrąć plazmid, który próbujesz wyciąć, lub wykonaj nową ekstrakcję fenolem przed wytrąceniem i spróbuj ponownie. W przeciwnym razie sprawdź, czy enzym jest nadal w porządku, używając innego plazmidu.
• działa, ale wektor nie jest całkowicie pocięty po 40 minutach (widoczne jako więcej niż jedno pasmo obecne przy przybliżonej masie cząsteczkowej, której oczekujesz od wektora). Na podstawie postępu można oszacować, ile czasu to zajmie i spróbować kolejnego trawienia.
• dokonano całkowitego trawienia. Masz liniowy plazmid, który jest gotowy do użycia w procedurze ligacji.

Wskazówka: Enzymy restrykcyjne są bardzo wrażliwe na zmiany temperatury, więc unikaj umieszczania ich w lodzie. Najlepiej użyć lodówki o temperaturze -20 °C. Należy również unikać przytrzymywania ich palcami na dnie probówki i starać się pracować szybko podczas obchodzenia się z zapasami enzymów. Będą one trwać długo, jeśli będziesz o nie dbać.

Fragment Restriction Digestion

Jest to protokół trawienia przygotowawczego, które polega na cięciu DNA w celu przygotowania go do ligacji z innym fragmentem DNA, a nie tylko w celu potwierdzenia tożsamości DNA. Zazwyczaj te fragmenty DNA są kolistymi plazmidami, ale mogą to być również fragmenty PCR. Należy dążyć do jednoczesnego trawienia zarówno fragmentu, jak i wektora.

Protokół ten zakłada roztwór plazmidu w Tris-EDTA (TE) lub buforze elucyjnym (EB) lub wolnym od nukleazy H₂O, który wynosi 200-300 ng/µL i około 3-5 kb. Większe plazmidy mogą wymagać użycia większej objętości, ponieważ przy tym samym stężeniu będzie mniej kopii plazmidu.

W tym konkretnym przykładzie można wykonać następujące czynności:

10-20 µL plazmidu (200-300 ng/μL, całkowita ilość 3-5 µg)
7,5 µL 10X buforu restrykcyjnego
7.5 µL < href="/PL/pl/product/sial/a7906">10X albuminy surowicy bydlęcej  (BSA, końcowe stężenie wynosi zwykle 100 µg/ml) (nr kat. A7906)
1,5-2 µL enzymu restrykcyjnego 1 (10-20 u/µL)
1.5-2 µL enzymu restrykcyjnego 2 (opcjonalnie)
Przygotować do 70 µL łącznie z TE (Nr kat. T9285) lub  wody wolnej od nukleazy (Nr kat. W4502)

Protokół trawienia restrykcyjnego fragmentów DNA

Umieść powyższe odczynniki w sterylnym 1.5 ml Eppendorf, najpierw dodaj TE lub wodę, następnie plazmid/DNA, następnie bufor restrykcyjny i BSA i dokładnie wymieszaj. Na koniec dodać enzym(y) restrykcyjny(e). Inkubuj reakcję w odpowiedniej temperaturze (zwykle 37 °C, ale zawsze upewnij się, że nie masz do czynienia z wyjątkiem, takim jak SwaI w 25 °C) i uruchom budzik (odliczaj w górę). Prowadzić reakcję przez 40-60 minut. Przeprowadź trawienie na żelu agarozowym (z bardzo dużą studzienką do załadowania dużej próbki) i sprawdź wyniki pod kątem pojedynczego pasma wielkości wstawki.

Gel Excission of DNA Fragments

Do wycięcia pasma potrzebny będzie czysty skalpel lub żyletka. Ważną kwestią jest ilość agarozy pobranej z DNA. Im wyższy jest stosunek ilości DNA do agarozy, tym mniej zanieczyszczeń zostanie przeniesionych do ligacji.

Standardową metodą stosowaną do ekstrakcji DNA z żeli agarozowych jest wizualizacja barwnika bromku etydyny (nr katalogowy  H5041) w świetle UV. Nie jest to idealne rozwiązanie, ponieważ promieniowanie UV uszkadza DNA i może powodować mutacje oraz zmniejszać wydajność ligacji. Alternatywą jest użycie transiluminatora Clare Chemical Dark Reader, ale czasami może być trudno zobaczyć pasma o małej ilości. Jeśli masz znaczną ilość DNA, te systemy są idealne. Alternatywnie można wykonać ślepą wycinkę, przeprowadzając niewielką ilość wyciętego DNA na pasie sąsiadującym z dużym dołkiem i wykorzystując jego pozycję do wycięcia dużej ilości DNA w następnym dołku. Bądź bardzo ostrożny z tą techniką, ponieważ niektóre pasma mogą być dość małe wzdłuż / od góry do dołu w żelu i mogą zostać pominięte, jeśli nie jesteś dokładny. Po wycięciu możesz spojrzeć na pozostały żel, aby sprawdzić, czy masz pasmo, zrób to szybko, ponieważ jeśli nie otrzymałeś DNA, nie chcesz go uszkodzić za pomocą UV.

Uważaj na fragmenty DNA, które są blisko siebie. Kluczem tej techniki jest oddzielenie szkieletu wektora od fragmentu, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Tylko dlatego, że nie widzisz czegoś podczas wycinania, nie oznacza, że tego nie ma, zobaczysz tylko szczyt gaussowskiego rozkładu DNA i chociaż pasma mogą wyglądać na oddzielne, mogą nie być i możesz uzyskać trochę DNA z pasm, które są blisko siebie przez przypadek.

Wskazówka: Jest to stosunkowo niebezpieczna procedura, jeśli chodzi o biologię molekularną. Światło UV, rakotwórczy bromek etydyny i skalpel to przepis na katastrofę. Przestrzegaj wszystkich lokalnych zasad i przepisów bezpieczeństwa i skonsultuj się z lokalnym urzędnikiem ds. bezpieczeństwa, jeśli nie masz pewności co do niezbędnych środków ostrożności. Zarówno  Nancy 520  (nr katalogowy  01494), jak i Syber Safe (nr katalogowy  01494). S9305 i S9430) okazały się mniej mutagenne niż bromek etydyny.

Clean Up of Gel Fragments

.Do ekstrakcji fragmentu DNA z żelu agarozowego zwykle nie warto używać niczego innego niż przygotowanego zestawu, takiego jak GenElute™ Gel Extraction Kit, nr katalogowy.NA1111. Są one stosunkowo tanie i wysoce skuteczne. Istnieją inne metody, które nie wymagają zestawu (takie jak rurki dializacyjne i zgniatanie fragmentu żelu między folią parafilmową w celu wyciśnięcia DNA w roztworze), ale często stosowanie tych metod skutkuje wysokim poziomem zanieczyszczeń i niską wydajnością DNA.

Zestawy do ekstrakcji żelowej DNA zwykle składają się z kulek lub kolumn wirujących. Rozmiary fragmentów DNA, które każdy zestaw może pomieścić, mogą się różnić, więc sprawdź, czy zestaw wyodrębni zakres wielkości DNA, z którym pracujesz. Większość zestawów obejmuje zakres od 100bp do 5 Kb, ale niektóre mają mniejszą lub większą pojemność.

Zasadą działania zarówno kolumn wirujących, jak i zestawów kulek jest wiązanie DNA z czymś (zwykle żywicą krzemionkową), a następnie wymywanie zanieczyszczeń, albo przez granulowanie kulek, albo płukanie kolumny. Końcowy etap elucji uwalnia DNA z żywicy / kulek / kolumny, aby zapewnić czysty fragment DNA. Jednak nawet najlepszy zestaw do ekstrakcji może nadal przenosić pewne zanieczyszczenia i z tego powodu należy unikać stosowania dużych objętości roztworu, który został wytworzony przez ekstrakcję żelową w ligacji. Czasami "mniej znaczy więcej", jeśli chodzi o dodawanie fragmentu do ligacji. Staraj się unikać sytuacji, w której ligacja składa się z więcej niż 30% objętości płynu wyizolowanego przez ekstrakcję żelową.

Zmienność zestawów do ekstrakcji żelowej

W naszych laboratoriach przetestowaliśmy sześć różnych zestawów do ekstrakcji żelowej DNA, ponieważ proces ten jest tak istotny dla naszej pracy. Odkryliśmy, że podczas gdy niektóre zestawy stale zapewniają wysoką wydajność i czyste DNA, inne czasami zapewniają dobrą wydajność, ale czasami zawodzą, a inne konsekwentnie osiągają gorsze wyniki.

Jeśli ekstrahujesz żelowo fragment z plazmidu, prawdopodobnie powinieneś spodziewać się, że stężenie DNA (jeśli używasz spektrofotometru) będzie niskie, ponieważ zacząłeś od dużego plazmidu (najprawdopodobniej około 5kb), a następnie wyciąłeś znacznie mniejszą podfrakcję (być może 1kb), a zestawy nigdy nie oczyszczą 100% DNA z żelu. Tak więc wydajność 20ng/ul w 35ul całkowitej objętości dla fragmentu 1Kb wyizolowanego z 5ug plamsidowego DNA (5Kb) nie byłaby zła (70% DNA zostało odzyskane).

Często stwierdzamy, że często poziom zanieczyszczeń lub jakość przygotowania DNA jest ważniejszym wyznacznikiem sukcesu klonowania niż sama wydajność DNA. Zaobserwowaliśmy również, że czasami dodanie większej ilości fragmentu do ligacji zmniejsza sukces klonowania w porównaniu do tej samej reakcji z nieco mniejszą ilością. Chociaż może to być po prostu spowodowane tym, że dodatkowe końce DNA miareczkują ligazę z dala od końców wektora, dodanie zbyt dużej ilości materiału wyekstrahowanego z żelu może przyczyniać się do tego z powodu niskiego poziomu zanieczyszczeń w prep z żelu.

Annealing DNA Oligos for Ligation

Podstawowa koncepcja wyżarzania oligonukleotydów polega na podgrzaniu dwóch oligonukleotydów tak, aby uległy denaturacji, a następnie schłodzeniu, aby umożliwić sparowanie dwóch oligonukleotydów. W przypadku niestandardowych oligos, patrz OLIGO). Proces ten jest często wykorzystywany do przygotowania krótkich odcinków DNA w celu:

• Tworzenia regionów DNA shRNA do ligacji
• Tworzenia regionów DNA mikroRNA do ligacji
• Dodania łącznika w celu usunięcia lub dodania miejsca restrykcji.
• Badania wymagające małych regionów dwuniciowego DNA, takie jak testy wiązania białek DNA.

Koszt zakupu wielu fosforylowanych oligos może być zaporowy. Z tego powodu wiele grup po prostu liguje oligo do wektorów, które nie zostały pozbawione fosforylacji. Jest to szczególnie skuteczne, gdy oligo mają być ligowane do wektora, który został przecięty dwoma oddzielnymi enzymami restrykcyjnymi, które mają niekompatybilne końce (zapobiegając zamknięciu się wektora). Tło z ligacji może być nadal wysokie, ale oligo są często w znacznym nadmiarze w ligacjach oligo, więc reakcja powinna nadal działać.

Możliwe jest również fosforylowanie oligo najpierw przy użyciu kinazy polinukleotydowej (PNK), ale czyszczenie oligo jest trudne, ponieważ prawdopodobnie nie będą one wiązać kolumny oczyszczającej DNA ze względu na ich krótką długość. Jednak reakcje PNK są przeprowadzane w buforze ligazy, więc może to nie być konieczne, ale PNK musi być inaktywowana termicznie przed wprowadzeniem oligo do ligacji, w przeciwnym razie PNK będzie fosforylować wektor.

.Chemia fosforoamidytów, za pomocą której generalnie wytwarzane są oligo, może być zwykle stosowana do wytwarzania 40-50 zasad bez zbyt wielu błędów, jednak stosowanie tej techniki do wytwarzania oligo 100 zasad lub dłuższych często prowadzi do mutacji. Często stwierdzaliśmy, że lepiej jest podzielić długie oligo na dwa krótsze oligo z 10-15 parami zasad zachodzącymi na siebie w środku na przeciwległym oligo, aby umożliwić im połączenie się. Częstotliwość mutacji po sekwencjonowaniu powinna być znacznie niższa.

Rozważ etap chłodzenia. Próbowaliśmy schłodzić oligo w łaźni wodnej, po prostu podgrzewając ją do 95 stopni, a następnie wyłączając, aby ostygła, lub podgrzewając je do 100 stopni w zlewce na statywie (stara szkoła), a następnie umieszczając zlewkę w lodowatej wodzie (i oligo w probówce wewnątrz zlewki), aby ostygły. Próbowaliśmy również umieścić oligo w maszynie PCR ustawionej na 5 stopni chłodzenia co 30 sekund. W rzeczywistości metoda nie robi dużej różnicy. Pozostawienie ich zbyt długo w wysokiej temperaturze może prowadzić do hydrolizy, dlatego unikamy wyłączania łaźni wodnej. Zazwyczaj podgrzewamy oligos do 95 stopni w łaźni wodnej w zlewce z probówką oligos w eppendorfie na pływaku. Następnie umieszczamy je w lodowatej wodzie na 10 minut. Wydaje się, że działa to dobrze dla nas, ale inne metody mogą również działać dla Ciebie.

Projektowanie oligos z nawisami, które odtwarzają miejsca, do których oligo ma być wstawione, może być trudne. Poniższy schemat przedstawia przykład tego, jak mogą wyglądać oligo, w tym przykładzie oligo mają być podwiązane do miejsc restrykcyjnych NcoI i XbaI.

Protokół wyżarzania oligos DNA

Wskazówka: Zapasy oligo i primerów są często zawieszane w stężeniach 100 µM (100 pikomoli/ul).

1. Dodaj 10 µL zapasów oligo (zakładając, że masz dwa do wyżarzania) do 25 µL wody wolnej od nukleazy (Nr kat. W4502) do 1,5 ml mikrotuby.
2. Dodaj 5 µl buforu do trawienia restrykcyjnego (takiego jak 100 mM  NaCl   (nr katalogowy  S3014), 50 mM  Tris-HCl   (nr katalogowy. 93362), 10 mM MgCl₂ (Nr katalog. M0250), 1 mM Dithiothreitol (Nr katalogowy  D0632), pH 7,9. Obecność buforu pomaga utrzymać prawidłowe pH dla stabilności DNA, a sól powinna promować annealing. Stężenie oligo wynosi teraz 20 pikomoli/ul.
3. Upływaj probówką w zlewce w wodzie podgrzanej do 95 stopni przez 5 minut.
4. Umieść zlewkę w pojemniku na lód wypełnionym lodem i wodą, aby umożliwić schłodzenie zlewki przez 10 minut.
5. Po ostygnięciu wody w zlewce rozcieńczyć oligo 10-krotnie i 100-krotnie w wodzie i dodać 1 µL tego do standardowej reakcji ligacji 20 µL. Pokusą jest dodanie większej ilości, ale to tylko zmiareczkuje ligazę z końców wektora na dodatkowe oligo, co może zmniejszyć wydajność ligacji. Końcowe stężenie oligos w ligacji wyniesie około 2 lub 0,2 pikomola/µL. Nadal będzie to znaczny nadmiar oligos w stosunku do wektora.

Dodawanie 5' fosforanów do DNA

.

Ligaza DNA T4 wymaga fosforanu 5' na jednej z cząsteczek DNA, które mają być ligowane w celu przyłączenia DNA, z tego powodu często konieczne jest fosforylowanie cząsteczki DNA przed dodaniem jej do ligacji, na przykład podczas tępego klonowania produktu PCR.

Protokół fosforylacji DNA

Woda wolna od nukleazy (Nr kat. W4502): 4,5 ul
Produkt PCR lub inne DNA (oczyszczone): 4 ul (jeśli produkt PCR ma wgłębione lub tępe końce 5', podgrzej go do 70 °C przez 5 minut i ostudź na lodzie przed dodaniem do reakcji)
10 x bufor ligazy DNA T4: 1 ul (bufor ligazy jest używany, ponieważ zawiera ATP)
Kinaza polinukleotydowa T4: 0,5 ul

Inkubować reakcję (reakcje) kinazy przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Ufosforylowany produkt PCR może być następnie użyty bezpośrednio w reakcji ligacji bez oczyszczania (na przykład podczas wykonywania mutagenezy ukierunkowanej na miejsce). Jeśli produkt PCR ma być ligowany do wektora pozbawionego fosforylacji, dobrym pomysłem może być inaktywacja cieplna enzymu PNK, aby zapobiec fosforylacji wektora szkieletowego i prowadzeniu do wysokiego tła. Osiąga się to poprzez inkubację reakcji przez 20 minut w temperaturze 65 °C.

Defosforylujące DNA

Celem defosforylacji wektora jest zapobieganie jego ligacji z powrotem na siebie podczas etapu ligacji poprzez usunięcie 5' grup fosforanowych, które są wymagane przez ligazę DNA do połączenia fosfodiestrowego szkieletu DNA. Istnieją różne fosfatazy alkaliczne, w tym fosfataza jelitowa cieląt (CIP), fosfatazy krewetkowe i antarktyczne. CIP (Nr kat.P4978) jest najczęściej stosowaną, ale trudną do inaktywacji termicznej. Temperatura i bufory różnych enzymów mogą być różne, należy zapoznać się z instrukcjami producenta.

Protokół defosforylacji DNA w reakcji trawienia restrykcyjnego

50-100 µL DNA (5 µg) w reakcji/roztworze trawienia restrykcyjnego
1-2 µL enzymu CIP (1 jednostka/µL)

1. Dodaj 1-2 µL CIP do trawienia restrykcyjnego. CIP jest stabilny i aktywny w większości buforów do trawienia restrykcyjnego.
2. Inkubuj próbkę przez 30-60 minut w temperaturze 37 °C.

Protokół dephosforylacji DNA w TE lub H₂O

20-40 µL DNA (5µg) w TE (Nr kat. T9285) lub  nukleazy H₂O (Nr kat. W4502)
5 µL buforu 10xCIP
1-2 µL enzymu CIP (1 jednostka/µL)
Uzupełnić do 50 µL

1. W sterylnym 1.5 ml eppendorfie dodać DNA, następnie bufor CIP i 1-2 µL enzymu CIP.
2. Dokładnie wymieszaj za pomocą końcówki pipety i inkubuj przez 30-60 minut w temperaturze 37 °C.

Wskazówka 1: Upewnij się, że fragment, który zamierzasz ligować do zdrifosforylowanego wektora posiada grupy 5'fosforanowe. Standardowe oligo/primery i produkty PCR zazwyczaj nie są fosforylowane i muszą być traktowane kinazą polinukleotydową T4 (patrz fosforylacja końców 5'). Zazwyczaj łatwiej jest dodać miejsca restrykcyjne na końcach produktu PCR (plus kilka dodatkowych par zasad na końcach), niż fosforylować fragment.

Wskazówka 2: CIP jest przechowywany w buforze glicerolowym w celu zapewnienia stabilności, ale oznacza to, że opada na dno roztworów wodnych. Podczas dodawania CIP należy obserwować, jak spada do mieszaniny DNA, robiąc to z probówką trzymaną przed sobą, a następnie upewnić się, że jest prawidłowo ponownie zawieszony przed inkubacją.

Protokoły klonowania tępego DNA

Czasem konieczne jest na przykład stępienie końców cząsteczki DNA:

• Podczas tworzenia biblioteki DNA
• Podcięte DNA z postrzępionymi końcami, które muszą być sklonowane do wektora

W sytuacji, gdy wybór kompatybilnych miejsc restrykcyjnych jest niemożliwy, wymagające wektora i wstawki, lub obu, do stępienia przed ligacją (może być ostatecznością). Istnieją dwie opcje: użycie polimerazy DNA (takiej jak Klenow lub T4) lub nukleazy fasoli Mung. Polimerazy DNA Klenow i T4 wypełniają zwisy 5' i usuwają zwisy 3'. Jeśli trzeba wypełnić zwis 5', każdy enzym będzie odpowiedni, ale jeśli trzeba usunąć zwis 3', T4 może być lepszym wyborem, ponieważ ma silniejszą aktywność egzonukleazy od 3' do 5'. Nukleaza z fasoli mung przeżuwa zarówno 5' jak i 3' nawisy.

Protokół stępiania Klenowa

1. DNA należy rozpuścić w 1x buforze do trawienia restrykcyjnego lub buforze reakcyjnym z ligazą DNA T4 uzupełnionym 33 μM każdego dNTP [stężenie końcowe].
2. Dodać 1 jednostkę Klenow na mikrogram DNA i inkubować przez 15 minut w temperaturze 25 °C.
3. Zatrzymaj reakcję dodając EDTA do końcowego stężenia 10mM, a następnie ogrzewając w 75 °C przez 20 minut.

Metoda stępiania T4

1. DNA należy rozpuścić w 1x buforze do trawienia restrykcyjnego & uzupełnionym 100 µM dNTPs [końcowe].
2. Dodaj 1 jednostkę polimerazy DNA T4 na mikrogram DNA i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 12 °C.
3. Zatrzymaj reakcję dodając EDTA do końcowego stężenia 10 mM i ogrzewając do 75 °C przez 20 minut.

Metoda stępiania nukleazy fasoli mung

1. Zawiesić DNA (0.1 μg/μL) w 1X buforze nukleazy fasoli Mung lub buforze enzymu restrykcyjnego
2. Dodaj 1.0 jednostkę nukleazy fasoli Mung na μg DNA.
3. Inkubuj w temperaturze 30 °C przez 30 minut.

Nie próbuj inaktywować termicznie nukleazy fasoli Mung, ponieważ jednoniciowe regiony DNA mogą pojawić się przed inaktywacją enzymu, powodując niezamierzoną degradację. Enzym należy inaktywować poprzez oczyszczanie na kolumnie wirówkowej lub ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolem.

.Protokół ligacji DNA

Podczas procesu klonowania wszystkie drogi prowadzą do ligacji, a więc wszystkie kroki, które ją poprzedzają, mogą znacząco wpłynąć na jej skuteczność. Ważne jest, aby przeczytać wskazówki i uwagi w każdej sekcji przed reakcją ligacji.

Reakcje ligacji są konfigurowane wraz z kontrolami. Zazwyczaj masz dwie kontrole, które są następujące:

• Sam wektor bez ligazy (kontrole dla nieciętego wektora)
• Wektor z ligazą (kontrole dla niewystarczającej defosforylacji, gdy jest używany w połączeniu z kontrolą 1)
• Prawdziwa ligacja, która jest wektorem + fragmentem + ligazą.

Jeśli otrzymałeś kolonie na kontroli 1, to twoje trawienie restrykcyjne wektora nie zadziałało, ponieważ otrzymałeś kolonie nawet bez ligazy. Jeśli masz kolonie na kontroli 2, ale nie 1, to leczenie fosfatazą alkaliczną nie zadziałało. Dzieje się tak dlatego, że trawienie zadziałało dobrze (brak kolonii na kontroli 1), ale ligaza była w stanie ponownie zwinąć plazmid, ponieważ fosforany 5' nie zostały usunięte podczas defosforylacji. Jeśli masz kolonie na 3 i żadnych (lub tylko mniej) na 1 i 2, to powinieneś sobie pogratulować, zebrać kilka kolonii i iść do domu na filiżankę herbaty, aby świętować.

Warunki reakcji mogą się różnić w zależności od laboratorium. Najlepsze wyniki osiąga się w temperaturze 16 °C przez noc, ale oznacza to dodanie dodatkowego dnia do całego procesu (co czyni go 4-dniowym cyklem klonowania). Przeprowadzenie ligacji w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny zwykle daje dobre wyniki i skraca klonowanie do 3 dni dla pełnego cyklu. Pod warunkiem, że nie przeszkadza ci długi pierwszy dzień.

Dwa najtrudniejsze typy ligacji to ligacja produktów PCR i ligacja tępa. Należy oczekiwać, że będą one mniej wydajne niż standardowe klonowanie fragmentu z jednego wektora do drugiego.

Typową reakcję można skonfigurować w następujący sposób:

Próbka	Wektor	Fragment	10x Bufor Ligazy	Ligaza (1U/µL)	Woda
Ligacja	1 µL	3 µL	2 µL	1 µL	13 µL
Kontrola 1	1 µL	-	2 µL	1 µL	16 µL
Kontrola 2	1 µL	-	2 µL	-	17 µL

1. Reakcję rozpocznij od dodania składników, które są wspólne dla wszystkich reakcji, tj. dodaj wodę, następnie bufor, a następnie wektor do każdej z probówek.
2. Następnie dodaj fragment do probówki ligacyjnej.
3. Na koniec dodaj ligazę do probówki ligacyjnej i właściwej probówki kontrolnej. Nie worteksuj reakcji, ponieważ ligaza DNA jest wrażliwa na ścinanie. Zamiast tego wymieszaj końcówką, którą dodałeś ligazę, dobrze mieszając i / lub delikatnie przesuwając probówkę palcem.
4. Inkubuj przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub 16 ° C przez noc. Niektórzy inaktywują ligację termicznie w temperaturze 65 °C przez 20 minut, ale nie jest to bezwzględnie konieczne.
5. Po zakończeniu ligacji użyj plazmidu do transformacji bakterii, abyś mógł bezpośrednio wyrazić białko lub wyhodować wiele kopii plazmidowego DNA do dalszego wykorzystania.

Wskazówka 1: BSA w buforze ligazy może wytrącić się podczas rozmrażania, widoczny jako biały osad na dnie buforu. Ponownie zawiesić przez worteksowanie i tymczasowe ogrzanie między palcami lub w temperaturze 37 °C.

Wskazówka 2: Bufor ligazy zawiera ATP, który ulega degradacji po wielu cyklach zamrażania i rozmrażania. Przechowuj zapasy buforów w małych porcjach i wyrzuć je po 3 cyklach.

Porada 3: Podgrzewanie ligacji (przed dodaniem enzymu) do 37 °C przez kilka minut w celu otwarcia lepkich końców lub pomoc w linearyzacji przejściowo recyrkulowanych wektorów przy użyciu ligacji z pojedynczym miejscem restrykcyjnym. Schłodzić ligację z powrotem do temperatury pokojowej przed dodaniem enzymu, aby uniknąć uszkodzenia ligazy podczas jej dodawania. Nie robimy tego, ale słyszeliśmy, że może to pomóc innym, którzy to robią.

Porada 4: Traktowanie produktów PCR Proteinazą K przed ligacją pomaga w ligacji. Ekstrakcja żelowa produktu PCR sprawiłaby, że byłoby to niepotrzebne, podobnie jak użycie zestawu do czyszczenia PCR w celu jego oczyszczenia.

Porada 5: Unikaj wystawiania DNA na działanie promieni UV podczas ekstrakcji z żelu. W niektórych przypadkach może to znacznie zmniejszyć wydajność ligacji.

Porada 6: Unikaj używania więcej niż 20-30% całkowitej objętości ligacji (zwykle całkowita objętość wynosi 20 μL) materiału oczyszczonego z żelu. Jeśli to zrobisz, możesz mieć zbyt dużo soli i innych zanieczyszczeń w reakcji, a wydajność ligacji może być zmniejszona.

Wskazówka 7: Ilość wektora powinna być ledwo widoczna, gdybyś miał go uruchomić na żelu agarozowym, więc około 20-30 nanogramów. Fragmenty powinny być bardziej obfite, ale nie bardziej niż 5-10-krotnie skoncentrowane w porównaniu do wektora. Zwykle stosujemy stosunek wektora do fragmentu 1:2 lub 1:3.

Obliczanie stosunku insertu do wektora

Stosunek molowy insertu do wektora może mieć znaczący wpływ na wynik ligacji i kolejnych etapów transformacji. Stosunek molowy może wahać się od 1:1 insertu do wektora do stosunku 10:1. Może być konieczne wypróbowanie kilku proporcji równolegle, aby uzyskać najlepsze wyniki. Poniższe obliczenia podają ilość fragmentu w stosunku do wektora przy stosunku 6:1 (fragment:wektor). Zmień 3 na cokolwiek, aby obliczyć alternatywne stężenia.

Protokół Mutagenezy Kierowanej Miejscem

Mutageneza Kierowana Miejscem (SDM) jest użyteczną techniką wprowadzania określonej mutacji do plazmidu w określonym miejscu. Mutacja może być substytucją, insercją lub delecją. Istnieje wiele zastosowań SDM, na przykład do oceny funkcji niektórych aminokwasów w enzymie, do badania wpływu zmiany zasad w promotorze lub usuwania miejsc restrykcyjnych z plazmidu.

Opisujemy tutaj metodę mutagenezy ukierunkowanej na miejsce opartą na PCR. Podstawową zasadą jest zaprojektowanie pary starterów PCR, tak aby cały plazmid był amplifikowany metodą PCR. Jeden z tych starterów zawiera pożądaną mutację. PCR tworzy liniowy produkt, którego końce można następnie połączyć (po fosforylacji) za pomocą ligazy DNA. Kolisty wektor jest transformowany do bakterii E. coli.

Krok 1: Proces mutagenezy i projektowanie starterów

Zaprojektuj parę starterów zawierających pożądaną mutację na końcu 5' jednego z nich. Zaprojektuj je tak, aby region komplementarny miał Tm około 60 °C.

Przykład:

Zwróć uwagę, że tylko starter do przodu zawiera mutację, więc możesz łatwo wykonać serię różnych mutacji, zachowując ten sam starter odwrotny, ale używając różnych starterów do przodu. Powyższy przykład dotyczy substytucji 3 bp, ale insercję można wykonać w ten sam sposób. Jeśli wymagana jest bardzo duża substytucja lub insercja, zmutowane zasady można wprowadzić na końcu 5' obu starterów.

Delecje o dowolnej wielkości można wykonać, oddalając od siebie startery do przodu i do tyłu na matrycy.

Startery PCR zwykle nie mają grupy fosforanowej na swoich końcach 5' ze względu na sposób ich syntezy. Oznacza to, że końce produktu PCR nie mogą być po prostu ligowane razem, muszą być najpierw fosforylowane. Istnieją dwie główne opcje: 1) można zamówić startery z fosforanem już dodanym do końca 5' lub 2) można fosforylować produkt PCR przy użyciu kinazy polinukleotydowej (PNK). Fosforylowane startery są dobrym pomysłem, jeśli wykonujesz tylko kilka SDM i nie masz żadnego PNK w zamrażarce (plus to eliminuje jeden krok). Użycie PNK jest bardziej opłacalne, jeśli wykonujesz wiele SDM (prawdopodobnie 10 lub więcej).

Krok 2: PCR

Ważne jest, aby użyć polimerazy korekcyjnej, aby uniknąć wprowadzenia jakichkolwiek innych mutacji. Niemniej jednak, jeśli nadal obawiasz się wprowadzenia mutacji, możesz podklonować zmutowany fragment z powrotem do tego samego szkieletu po mutagenezie.

Ponieważ metoda ta opiera się na PCR, zwykle działa lepiej na mniejszych plazmidach. Najlepiej jest postępować zgodnie z instrukcjami dołączonymi do polimerazy, ale skonfigurować PCR podobny do tego przykładu:

35,5 μL wody
5 μL 10x buforu polimerazy
1,5 μL startera do przodu (0. 3μM finalnie)
1,5 μL startera do tyłu (0.3 μM końcowy)
5 μl dNTPs (200 μM końcowy)
1 μl szablonowego DNA (rozcieńczenie 1 na 100 z mini-preparatu)
0,5 μl polimerazy

Reakcję należy przeprowadzić na lodzie, a probówkę przenieść do wstępnie ogrzanego bloku PCR bezpośrednio po wymieszaniu reakcji.

Program PCR:

1. 98 °C 60 sekund
   
2. 98 °C 8 sekund
   
3. 55-65 °C 20 sekund
   
4. 72 °C (czas wydłużania zależy od wielkości plazmidu i rodzaju użytej polimerazy) powtórzyć kroki 2-4 jeszcze 27-30 razy
   572 °C 5 minut

Utrzymać w temperaturze pokojowej.

Krok 3: Oczyszczenie produktu PCR

Przeprowadź całą reakcję na żelu agarozowym. Wyodrębnij pasmo i oczyść DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelowej, eluując je w 30 μL.

Krok 4: Fosforylacja końców 5'

*Ten krok można pominąć, jeśli w PCR użyto fosforylowanych oligos.

4,5 μL Wody wolnej od nukleazy  (Nr kat. W4502)
 Produkt PCR
1 μL 10x T4 DNA Ligase buffer*
0.5 μL kinazy polinukleotydowej T4

Inkubować w temperaturze 37 °C przez 40 min.

* Bufor ligazy jest używany, ponieważ zawiera już ATP i PNK jest w nim aktywna.

Krok 5: Ligacja końców DNA

Ustaw reakcję ligacji na lodzie.

6.7 μL wody wolnej od nukleazy  (Nr kat. W4502)
2 μL PNK Reaction (z kroku 5)
0.8 μL buforu 10x T4 DNA Ligase
0,5 μL T4 DNA Ligase

Inkubować w temperaturze 16 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.

Krok 6: Transformacja do kompetentnej E. coli

Krok 7: Potwierdzenie mutacji przez sekwencjonowanie DNA

.