Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)

Odczynniki i sprzęt

1. 20x Bufor soli i cytrynianu sodu (SSC: 3 M NaCl, 0.3 M cytrynian sodu, pH 7 lub produkt nr  S6639)
2. RNaza A (produkt nr  R4642) 100 µg/ml w 2x SSC
3. Pepsyna (Nr produktu  P6887) 40 jednostek/ml w 10 mM HCl
4. Paraformaldehyd, EM grade (Product No. P6148) świeżo zdepolimeryzowany, 4% w/v w wodzie
5. Etanol
6. Znakowana sonda. Plazmidowe DNA jest znakowane biotyną-11-dUTP przy użyciu starterów do translacji niklowej lub starterów losowych A3803 (np.g., ADVANCE™ Nick Translation Kit)
7. Roztwór mieszaniny hybrydyzacyjnej: 50% formamid (Product No. F7508), 10% siarczan dekstranu (Product No. D8906), 0,1% SDS (Product No. L4390), 0,5-1,5 ng/µl znakowanej sondy i 300 ng/mL DNA spermy łososia (Nr produktu. D7656) w 2x SSC
8. Bufor płuczący: 20% formamid (Nr produktu  F7508) w 0,1x SSC
9. Bufor do wykrywania: 0,2% Tween 20 (Product No. P1379) w 4x SSC
10. Bufor blokujący: 5% albumina bydlęca (Product No. A3803) w buforze do wykrywania
11. Przeciwciało lub związek wykrywający (np, Streptavidin-Cy3, nr produktu  S6402) w buforze blokującym
12. DAPI (nr produktu  D9542) 2 µg/ml w podłożu montażowym zapobiegającym blaknięciu.
13. Mikroskop fluorescencyjny, filtry i opcjonalny potrójny filtr pasmowoprzepustowy (x58, Omega Optics)
14. Szkiełka mikroskopowe (nr produktu  D9542). S8400)
15. Plastikowe szkiełka nakrywkowe do etapów inkubacji i hybrydyzacji (wycięte z autoklawowalnych worków na odpady, np, Nr produktu  B4408)
16. Blok cieplny/modyfikowany termocykler
17. Słoiki Coplin do etapów płukania (Nr produktu. S6016, S5641 lub S5891)

.

Procedura

Przygotowanie slajdu
Hybrydyzacja
Detekcja

Przygotowanie slajdów

1. Zacznij od przygotowania chromosomów z dowolnego typu komórek.
2. Inkubować z 200 µL RNazy przez 1 godzinę w 37 °C
3. Płukać szkiełka w 2x SSC przez 5 minut. Powtórzyć.
4. Płukać szkiełka w 10 mM HCl.
5. Inkubować z 200 µL pepsyny przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
6. Płukać szkiełka w dejonizowanej H₂O.
7. Płukać szkiełka w 2x SSC przez 5 minut. Powtórzyć.
8. Stabilizować szkiełka w paraformaldehydzie przez 10 minut.
9. Płukać szkiełka w 2x SSC przez 5 minut. Powtórzyć.
10. Wysuszyć szkiełka w serii etanolu: 70%, 80%, 95%; po 2 minuty.
11. Suszyć powietrzem.

Hybrydyzacja

1. Przygotuj 30 µl roztworu do hybrydyzacji na szkiełko. Podgrzać do 70 °C przez 10 minut i umieścić na lodzie.
2. Umieścić 30 µl roztworu do hybrydyzacji na każdym szkiełku i przykryć plastikowym szkiełkiem nakrywkowym.
3. Denaturować szkiełko w temperaturze 65-70 °C przez 5 minut na bloku grzejnym.
4. Stopniowo obniżać temperaturę do 37 °C.
5. Hybrydyzuj w temperaturze 37 °C przez noc w komorze wilgotnościowej.

Detection

1. Wash slides in 2x SSC to remove coverslip.
2. Płukać szkiełka w buforze płuczącym w temperaturze 40 °C przez 5 minut. Powtórzyć.
3. Płukać szkiełka w 0,1x SSC w temperaturze 40 °C przez 5-15 minut.
4. Płukać szkiełka w 2x SSC w temperaturze 40 °C przez 5-15 minut.
5. Ochłodzić szkiełka do temperatury pokojowej.
6. Wyrównać szkiełka w buforze do wykrywania przez 5 minut.
7. Blokować w buforze blokującym przez 20-30 minut.
8. Inkubować z 50 µl przeciwciała lub związku wykrywającego przez 30-60 minut (np, 5 µg/ml streptawidyny-Cy3 w buforze blokującym).
9. Płukać szkiełka w 2x SSC przez 5 minut. Powtórzyć dwukrotnie.
10. Barwić kontrfotograficznie roztworem DAPI przez 10 minut.
11. Krótko spłukać i zamontować w podłożu montażowym zapobiegającym blaknięciu.
12. Analizować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
    

Referencje

1. Heslop-Harrison J, Schwazarcher T, Anamthawat-Jónsson K, Leitch AR, Shi M. 1991. In situ hybridization with automated chromosome denaturation. Technique. 3109-15.

2. Leitch AR. 1994. In situ hybridization : a practical guide. Oxford (England): BIOS Scientific Publishers.

3. Harris N, Oparka KJ. 1994. Plant Cell Biology: A Practical Approach. Oxford (England): Oxford University Press.