Testy żywotności i proliferacji komórek
- Testy proliferacji syntezy DNA
- Testy proliferacji metabolicznej
- Luminescencyjne testy żywotności komórek
- Testy proliferacji barwników fluorescencyjnych
- 3D Cell Culture- Live/Dead/Total Cell Triple Staining
- Trypan Blue Cell Counting
Wprowadzenie
Testy do pomiaru proliferacji komórkowej, żywotności komórek i cytotoksyczności są powszechnie stosowane do monitorowania odpowiedzi i zdrowia komórek w hodowli po leczeniu różnymi bodźcami. Właściwy wybór metody testu zależy od liczby i rodzaju użytych komórek, a także oczekiwanego wyniku. Testy proliferacji komórek mogą monitorować liczbę komórek w czasie, liczbę podziałów komórkowych, aktywność metaboliczną lub syntezę DNA. Liczenie komórek przy użyciu barwników żywotności, takich jak błękit trypanu lub kalceina-AM, może zapewnić zarówno szybkość proliferacji, jak i procent żywotnych komórek.
Przegląd testów żywotności i proliferacji komórek
Testy proliferacji syntezy DNA
Test proliferacji komórek z użyciem BrdU
Proliferacja komórek może być badana poprzez monitorowanie wbudowywania radioizotopu [3H]-tymidyny do komórkowego DNA, a następnie autoradiografię. Alternatywnie, zamiast tymidyny można użyć 5-bromo-2′-deoksy-urydyny (testy BrdU). Komórki, które włączyły BrdU do swojego DNA, można łatwo wykryć za pomocą przeciwciała monoklonalnego przeciwko BrdU i przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z enzymem lub fluorochromem.
Rysunek 1.A, Proliferujące komórki w oku zarodka pisklęcia E4 przy użyciu barwienia BrdU B, Walidacja przeciwciała anty-BrdU przy użyciu kamptotecyny. Traktując komórki Jurkat środkiem zatrzymującym cykl komórkowy kamptotecyną, krążące komórki są uwięzione w przejściu fazy G1/S.
Testy proliferacji EdU
Testy proliferacji EdU Baseclick zapewniają skuteczną metodę fluorescencyjnego wykrywania replikującego się DNA. Zmodyfikowany nukleozyd EdU jest dodawany do żywych komórek i włączany do replikującego się DNA. Indukowana Cu chemia kliknięć pozwala na szybkie przyłączenie sond fluorescencyjnych do EdU. Zapewnia to ilościowy sposób monitorowania proliferujących komórek. Testy są dostępne w różnych formatach do obrazowania mikroskopowego, cytometrii przepływowej, badań przesiewowych o wysokiej przepustowości oraz do in vivo eksperymentów. Cztery różne sondy fluorescencyjne o szczytowym wzbudzeniu 488, 555, 594 i 647 są dostępne do multipleksowania z innymi sondami fluorescencyjnymi.
Rysunek 2.Zestawy do proliferacji komórek Edu-Click zawierają EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydynę) w DNA podczas aktywnej syntezy DNA i są mierzone przy użyciu metody detekcji fluorescencyjnej typu "click-chemistry".
Testy metabolicznej proliferacji
Testy mierzące aktywność metaboliczną są odpowiednie do analizy proliferacji, żywotności i cytotoksyczności. Redukcja soli tetrazolowych, takich jak MTT, XTT i WST-1 do barwnych związków formazanu lub bioredukcja rezazuryny zachodzi tylko w komórkach aktywnych metabolicznie. Aktywnie proliferujące komórki zwiększają swoją aktywność metaboliczną, podczas gdy komórki narażone na toksyny będą miały zmniejszoną aktywność.
Testy proliferacji komórek MTT
MTT (bromek 3-[4,5-dimetylotiazol-2-ylo]-2,5-difenylotetrazoliowy; błękit tiazolilowy) jest rozpuszczalną w wodzie solą tetrazoliową dającą żółtawy roztwór po przygotowaniu w mediach lub roztworach soli bez czerwieni fenolowej. Rozpuszczony MTT jest przekształcany w nierozpuszczalny fioletowy formazan poprzez rozszczepienie pierścienia tetrazolowego przez enzymy dehydrogenazy. Ten nierozpuszczalny w wodzie formazan może być rozpuszczony przy użyciu izopropanolu lub innych rozpuszczalników, a rozpuszczony materiał jest mierzony spektrofotometrycznie przy użyciu absorbancji jako funkcji stężenia przekształconego barwnika.
XTT Cell Proliferation Assays
W przeciwieństwie do MTT, produkt rozszczepienia XTT jest rozpuszczalny w wodzie; etap solubilizacji nie jest zatem wymagany. Sól tetrazolowa XTT jest rozszczepiana do formazanu przez złożony mechanizm komórkowy. Ta bioredukcja zachodzi tylko w żywych komórkach i jest związana z produkcją NAD(P)H poprzez glikolizę. Ilość formowanego barwnika formazanu bezpośrednio koreluje z liczbą aktywnych metabolicznie komórek w hodowli.
Testy proliferacji komórek WST-1
Stabilna sól tetrazoliowa WST-1 jest rozszczepiana do rozpuszczalnego formazanu przez złożony mechanizm komórkowy, który zachodzi głównie na powierzchni komórki. Ta bioredukcja jest w dużej mierze zależna od glikolitycznej produkcji NAD(P)H w żywych komórkach. Ilość utworzonego barwnika formazanu bezpośrednio koreluje z liczbą aktywnych metabolicznie komórek w hodowli.
Przewodnik po protokołach: WST-1 Assay dla żywotności i proliferacji komórek. Protokoły, najczęściej zadawane pytania i rozwiązywanie problemów
Rysunek 3.Test MTT jest testem kolorymetrycznym służącym do oceny proliferacji komórek w oparciu o aktywność metaboliczną. Komórkowe enzymy oksydoreduktazy zależne od NAD(P)H odzwierciedlają liczbę żywych komórek. Enzymy te są zdolne do redukcji żółtego barwnika tetrazoliowego MTT 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowego bromku do nierozpuszczalnego formazanu, który ma purpurowy kolor.
Luminescencyjne testy żywotności komórek
Ponieważ ATP jest wskaźnikiem metabolicznie aktywnych komórek, liczbę żywotnych komórek można ocenić na podstawie ilości dostępnego ATP. Zestaw ATP Cell Viability Luciferase Assay oferuje wysoce czuły jednorodny test do ilościowego oznaczania ATP w hodowlach komórkowych. Zestaw ten wykorzystuje lucyferazę firefly do utleniania D-Lucyferyny i wynikającej z tego produkcji światła w celu oceny ilości ATP dostępnego w hodowlach komórkowych. Procedura czułego testu obejmuje pojedyncze dodanie koktajlu wykrywającego ATP bezpośrednio do komórek hodowanych w pożywce uzupełnionej surowicą. Nie jest wymagane płukanie komórek, usuwanie pożywki ani wielokrotne pipetowanie. Zestaw jest wystarczająco czuły, aby wykryć pojedynczą komórkę lub 0,01 pikomola ATP. Wytwarzany sygnał jest liniowy w zakresie sześciu rzędów wielkości. Odnosząc ilość ATP do liczby żywych komórek, test ma szerokie zastosowanie, począwszy od określenia liczby żywych komórek, poprzez proliferację komórek, aż po cytotoksyczność komórek.
Rysunek 4.Bioluminescencyjny test żywotności komórek lucyferazy ATP. Lucyferaza Firefly wykorzystuje ATP do utleniania D-Lucyferyny i wynikającej z tego produkcji światła w celu oceny ilości dostępnego ATP, która koreluje z liczbą i żywotnością komórek.
Testy proliferacji z użyciem barwników fluorescencyjnych
Znakowanie CFSE
Ester N-sukcynoimidylowy 5(6)-karboksyfluoresceiny (CFSE) jest popularnym wyborem do pomiaru liczby podziałów w populacji komórek. Po wejściu do komórki CFSE jest rozszczepiany przez wewnątrzkomórkowe esterazy, tworząc związek fluorescencyjny, a grupa estru sukcynoimidylowego kowalencyjnie reaguje z pierwszorzędowymi aminami na białkach wewnątrzkomórkowych. Po podziale intensywność fluorescencji każdej komórki potomnej zmniejsza się o połowę, umożliwiając proste wykrycie liczby podziałów komórkowych za pomocą cytometrii przepływowej. CFSE jest szeroko stosowana do pomiaru proliferacji limfocytów, w tym limfocytów T.
Podwójne barwienie żywych i martwych komórek
Podwójne barwienie żywych i martwych komórek może być wykorzystywane do jednoczesnego fluorescencyjnego wykrywania żywych i martwych komórek./PL/plCalcein-AM jest wysoce lipofilowym i przepuszczalnym dla błon komórkowych barwnikiem. Chociaż sama kalceina-AM nie jest cząsteczką fluorescencyjną, kalceina generowana z kalceiny-AM przez esterazę w żywej komórce emituje silną zieloną fluorescencję (λex 490 nm, λem 515 nm). Dlatego kalceina-AM barwi tylko żywe komórki. W przeciwieństwie do tego, barwnik barwiący jądra jod propidium nie może przejść przez błonę żywej komórki. Dociera do jądra przechodząc przez nieuporządkowane obszary martwej błony komórkowej i interkaluje z podwójną helisą DNA emitując czerwoną fluorescencję (λex 535 nm, λem 617 nm). Ponieważ zarówno kalceina, jak i PI-DNA mogą być wzbudzane światłem o długości fali 490 nm, możliwe jest jednoczesne monitorowanie żywych i martwych komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z pojedynczym wzbudzeniem.
Rysunek 5.Podwójne barwienie żywych/umarłych komórek
3D Cell Culture- Live/Dead/Total Cell Triple Staining
Zestaw do obrazowania żywotności komórek Cell Viability Imaging Kit to trójkolorowy test, który może być stosowany w hodowlach komórkowych 2D i 3D do jednoczesnego barwienia fluorescencyjnego żywych komórek (Calcein-AM), martwych komórek (Propidium Iodide/PI), a także komórek całkowitych (Hoechst 33342).
- Calcein-AM fluoryzuje na zielono po związaniu wapnia, opierając się na aktywności esterazy obecnej tylko w aktywnych metabolicznie żywych komórkach.
- Jodek propidium (PI) jest barwnikiem jądrowym, który jest wykluczany przez błonę żywych komórek, ale przechodzi przez uszkodzoną błonę martwych komórek, interkalując z DNA, aby emitować silną czerwoną fluorescencję.
- Hoechst 33342 to barwnik do barwienia DNA, który wykazuje niską cytotoksyczność. Fluoryzuje na niebiesko i jest używany jako wskaźnik całkowitej liczby komórek.
Liczenie komórek za pomocą błękitu trypanu
Błękit trypanu jest jednym z kilku barwników zalecanych do stosowania w procedurach wykluczania barwników w celu liczenia żywych komórek. Metoda ta opiera się na zasadzie, że żywe (żywotne) komórki nie pobierają niebieskiego barwnika, podczas gdy martwe (nieżywotne) komórki to robią. Żywotność komórek można obliczyć za pomocą stosunku całkowitej liczby żywych komórek do całkowitej liczby komórek (żywych i martwych). Barwienie ułatwia również wizualizację ogólnej morfologii komórek.
UWAGA: Błękit trypanu ma większe powinowactwo do białek surowicy niż do białek komórkowych. Jeśli tło jest zbyt ciemne z powodu obecności surowicy w matrycy, komórki powinny zostać osuszone i ponownie zawieszone w pożywce bezbiałkowej lub roztworze soli przed zliczeniem.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?