Wybór biotuszu do biodruku 3D

Czytaj więcej o

• Co to jest biodruk 3D?
• Co to są Bioinks?
• Jaką metodę biodruku 3D należy zastosować?
• Zakończenie
• Referencje

Co to jest biodruk 3D?

Bioprinting 3D umożliwia generowanie precyzyjnie kontrolowanych modele komórkowe 3D i konstrukcje tkankowe, poprzez inżynierię podłoży o anatomicznym kształcie i złożoności podobnej do tkanki. Ze względu na wysoki stopień kontroli nad strukturą i składem, biodruk 3D ma potencjał, aby rozwiązać wiele krytycznych niezaspokojonych potrzeb w badaniach medycznych, w tym zastosowania w testowaniu kosmetyków, odkrywaniu leków, medycynie regeneracyjnej i funkcjonalnej wymianie narządów.¹ Spersonalizowane modele chorób mogą być tworzone przy użyciu komórek macierzystych pochodzących od pacjenta, takich jak indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste  (komórki iPS) lub mezenchymalne komórki macierzyste. W zależności od zastosowania, można użyć szeregu materiałów, metod i komórek, aby uzyskać pożądany konstrukt tkankowy (Rysunek 1). Więcej szczegółowych informacji, w tym artykuły przeglądowe ekspertów na temat biodruku 3D, protokołów i powiązanych produktów, można znaleźć w naszym Podręczniku biodruku 3D.

Rysunek 1. Bioprinting 3D tkanek i narządów. Biotusze są tworzone poprzez połączenie hodowanych komórek i różnych materiałów biokompatybilnych. Biotusze mogą być następnie biodrukowane 3D w funkcjonalne konstrukcje tkankowe do badań przesiewowych leków, modelowania chorób i przeszczepów in vitro.

Czym są bioinki?

Bioinks zawierają żywe komórki oraz biomateriały które naśladują macierz zewnątrzkomórkową środowisko, wspierające adhezję, proliferację i różnicowanie komórek po wydrukowaniu. W przeciwieństwie do tradycyjnych materiałów do druku 3D, biotusze muszą posiadać:

• Temperatury druku, które nie przekraczają temperatur fizjologicznych
• Łagodne warunki sieciowania lub żelowania
• Składniki bioaktywne, które są nietoksyczne i zdolne do modyfikacji przez komórki po wydrukowaniu

Biożele do druku ekstruzyjnego

Hydroże enkapsulujące komórki są stosowane w biodruku 3D do tworzenia żywych struktur tkankowych poprzez tworzenie wielokomórkowych bloków konstrukcyjnych. Enkapsulacja komórek pozwala na precyzyjną kontrolę nad ich przyłączaniem oraz przestrzennym rozmieszczeniem komórek i biomolekuł w rusztowaniu, w porównaniu z innymi metodami i materiałami.¹ Łączenie wielu typów komórek i czynników wzrostu w określonym wzorze pozwala na generowanie wysoce złożonych konstrukcji tkankowych.³ Oprócz biokompatybilności, materiały do biodruku stosowane do enkapsulacji komórek muszą charakteryzować się wysoką zawartością wody i porowatością, umożliwiając enkapsulowanym komórkom przyjmowanie składników odżywczych i usuwanie odpadów.¹ Jako napęczniałe wodą, porowate sieci, hydrożele są idealnymi materiałami do enkapsulacji komórek, inżynierii tkankowej i zastosowań w biodruku 3D. Hydrożele do biodruku 3D muszą również charakteryzować się regulowaną sztywnością podłoża i umożliwiać przebudowę sieci po wydrukowaniu, aby komórki mogły się rozprzestrzeniać, migrować, proliferować i wchodzić w interakcje.⁹ Podczas gdy do produkcji biotuszów stosuje się szeroką gamę materiałów, najpopularniejsze z nich obejmują żelatynę metakrylową (GelMA), kolagen, poli(glikol etylenowy) (PEG), Pluronic^®, alginian i zdekellularyzowane materiały na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (Tabela 1).

Featured Bioink Material

Gelatin MethacryloylGelatin methacryloyl (GelMA) może być stosowany do tworzenia usieciowanych hydrożeli do inżynierii tkankowej i druku 3D. Biotusze na bazie GelMA charakteryzują się doskonałą cytokompatybilnością, regulowaną sztywnością podłoża, lepszą drukownością i szybkim sieciowaniem pod wpływem promieniowania UV lub światła widzialnego (w zależności od tożsamości fotoinicjatora)¹¹. GelMA był stosowany w morfogenezie komórek śródbłonka, kardiomiocytów, tkanki naskórka, wstrzykiwanych konstrukcjach tkankowych, różnicowaniu kości i regeneracji chrząstki. Metakryloil żelatyny był również stosowany w mikrosferach i hydrożelach do dostarczania leków.

Rysunek 2. Żelatyna metakryloilowa

Materiały komórkowe

Oprócz biotuszów, materiały acellularne są również wykorzystywane w bioprojektowanych strukturach 3D.² Materiały bezkomórkowe zazwyczaj zapewniają wsparcie strukturalne dla konstrukcji tkankowych, a w połączeniu z biotuszami mogą generować funkcjonalne, biodrukowane tkanki. Materiały bezkomórkowe są porowatymi strukturami, które odtwarzają zarówno mechaniczne, jak i biochemiczne właściwości natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)⁴. Porowatość umożliwia migrację komórek, wzrost tkanki, tworzenie naczyń krwionośnych i żywotność komórek w tych konstrukcjach strukturalnych.⁶  Ponadto, materiały acellularne muszą mieć również niezbędną chemię powierzchni do przyłączania, proliferacji i różnicowania komórek.⁵ Popularne materiały acellularne obejmują: kolagen, fibrynę, chitozan, nanocelulozę, poli(kwas mlekowy) (PLA), polikaprolakton (PCL), hydroksyapatyt (HA) i fosforan β-trójwapniowy (β-TCP) (Tabela 1).

Bloki konstrukcyjne materiałów do biokomponentów

Tabela 1 Biomateriały powszechnie stosowane w biodruku 3D.

Materiał Bioink	Przegląd	Zalety	Wady
< href="sigma/a9045">Agaroza
Agaroza	Polisacharyd ekstrahowany z wodorostów	Nietoksyczne sieciowanie Wysoka stabilność	Nie ulega degradacji; Słaba adhezja komórek
Alginian	Naturalnie otrzymywany biopolimer z alg brunatnych	Łagodne warunki sieciowania (Ca2+) Szybkie żelowanie Wysoka biokompatybilność	Powolna kinetyka degradacji; Słaba adhezja komórek
Chitosan	Polisacharyd otrzymywany z zewnętrznego szkieletu skorupiaków (np. krewetek).krewetki). Chitozan niepochodzący od zwierząt może być otrzymywany w wyniku fermentacji grzybów.	Wysoka biokompatybilność Właściwości antybakteryjne	Powolne tempo żelowania
kolagen	Podstawowe białko strukturalne występujące w skórze i innych tkankach łącznych	Wysokie znaczenie biologiczne	Rozpuszczalny w kwasach
Decellularized ECM	Isolated extracellular matrix of a tissue from inhabiting native cells	High biological relevance Specyficzna dla tkanki Wysoka przeżywalność komórek	Nieokreślona i niespójna; Utrata natywnej organizacji ECM; Niska stabilność
Fibryna/Fibrynogen	Nierozpuszczalne białko powstające podczas krzepnięcia krwi	Wysokie znaczenie biologiczne Szybka żelacja	Ograniczona drukowalność
Żelatyna	Substancja białkowa pochodząca z częściowej hydrolizy kolagenu	Wysoka biokompatybilność Wysoka rozpuszczalność w wodzie Żelowanie odwracalne termicznie	Niska wierność kształtu; Ograniczona sztywność
Grafen	Materiał na bazie węgla, który można postrzegać jako arkusz grafitu o grubości jednego atomu	Elastyczny Przewodzący prąd elektryczny	Małe znaczenie biologiczne
Kwas hialuronowy (HA)	Niesiarczanowany glikozaminoglikan szeroko rozpowszechniony w tkankach łącznych, nabłonkowych i nerwowych.	Szybko żeluje Promuje proliferację komórek	Niska stabilność
Hydroksyapatyt	Naturalnie występująca forma mineralna apatytu wapnia występująca w zębach i kościach<	Wysoka wytrzymałość i sztywność	Niska drukowność; Ograniczona specyficzność tkankowa
.PCL/PLA/PLGA	Biodegradowalne, termoplastyczne polimery i/lub kopolimery	Wysoka wytrzymałość i sztywność	Niska adhezja i proliferacja komórek
Pluronic® F127	Kopolimer blokowy poli(tlenku etylenu) i poli(tlenku propylenu)	Nadaje się do druku w temperaturze pokojowej Materiał rozrzedzany ścinaniem	Nie nadaje się do długotrwałej hodowli komórek

Jaką metodę biodruku 3D należy zastosować?

W zależności od rodzaju wybranego tuszu (bioink lub materiały acellularne) i złożoności ostatecznej konstrukcji tkanki, można zastosować różne metody druku 3D (Rysunek 1). Zalety i wady popularnych metod można znaleźć w poniższej tabeli (Tabela 2).

Tabela 2. Podsumowanie metod biodruku 3D.

Metoda drukowania	Zalety	Wady	Kompatybilny z komórkami?
Extrusion-based	Prędkość drukowania i struktury mogą być wysoce kontrolowane	Naprężenie ścinające może wpływać na żywotność komórek	Tak
Oparte na druku atramentowym	Szybkość druku Kompatybilność z komponentami biologicznymi Niski koszt	Wymaga materiałów o niskiej lepkości	Tak
Stereolitografia (SLA)	Wysoka rozdzielczość	Wymaga dużych ilości materiału Długi czas przetwarzania Długi czas drukowania może zmniejszyć żywotność komórek	Tak
Na bazie lasera	Może być używany z lepkimi materiałami Bardzo dokładny	Ciepło generowane przez laser może wpływać na komórki	Tak
Modelowanie topionego osadzania (FDM)	Daje wysoce porowate struktury	Materiały muszą wykazywać stopioną fazę Ciepło używane do topienia materiałów niekompatybilnych z komórkami< Trudne do wykonania złożonych geometrii	Nie
Selektywne spiekanie laserowe (SLS)	Możliwość tworzenia złożonych struktur Daje lepsze wiązanie między każdą wydrukowaną warstwą	Ciepło generowane przez laser nie jest kompatybilne z komórkami	Nie

Oprócz rodzaju atramentu, metoda biodruku może być również podyktowana końcowym zastosowaniem drukowanego konstruktu (Tabela 3).

Zastosowania inżynierii tkankowej

Tabela 3. Bioprinting 3D konstruktów tkankowych.

Model tkankowy	Używane komórki	Używana drukarka biologiczna	Używany materiał biokomponentu	Odniesienie
Użyty bioprinter	Użyty materiał bioink	Odniesienie
Chrząstka	Mezenchymalne Komórki macierzyste	HP® Drukarka Deskjet 500	Diakrylan PEG	Drukowane atramentowo peptydy akrylowe i hydrożel PEG z ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi promują silne tworzenie kości i chrząstki przy minimalnym zatykaniu głowicy drukującej
	komórki iPS/ chondrocyty	3DDiscovery™	Alginian/ Nanoceluloza	Inżynieria tkankowa chrząstki poprzez biodruk 3D komórek iPS w nanocelulozie/alginianie
	Chondrocyty	ITOP	PCL/Pluronic®	System biodruku 3D do produkcji konstruktów tkankowych na ludzką skalę o integralności strukturalnej
Kość	MC3T3-E1	In-House	Alginian/ Alkohol poliwinylowy/&hydroksyapatyt	Opracowanie nowego hydrożelu alginianowo-poliwinyloalkoholowo-hydroksyapatytowego do biodrukowania 3D rusztowań inżynierii tkanki kostnej
	Mezenchymalne komórki macierzyste	HP® Drukarka Deskjet 500	GelMA	Poprawa właściwości tkanki kostnej i chrzęstnej z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych drukowanych atramentowo 3D poprzez jednoczesne osadzanie i fotosieciowanie w PEG-GelMA
Skóra	Mezenchymalne komórki macierzyste	In-House	Fibryna/Kolagen I	Bioproteinowane komórki macierzyste pochodzące z płynu owodniowego przyspieszają gojenie dużych ran skóry
	.Keratynocyty/ Fibroblasty	In-House	Kolagen I	Projektowanie i wytwarzanie ludzkiej skóry metodą trójwymiarowego biodruku
Naczynia krwionośne	HUVEC/HUVSMC/ Fibroblasty	In-House	Agaroza	Inżynieria tkanki naczyniowej bez użycia rusztowań z wykorzystaniem biodruku
Mięśnie	Muscle Derived Stem Cells	In-House	Fibrin	Mikrośrodowiska zaprojektowane za pomocą biodruku atramentowego przestrzennie kierują dorosłe komórki macierzyste w kierunku subpopulacji mięśni i kości
Mózg	Neuralne komórki macierzyste	Wewnątrz firmy	Poliuretan	Bioprinting 3D termoresponsywnego biodegradowalnego poliuretanowego hydrożelu zawierającego neuronowe komórki macierzyste i jego potencjał w naprawie centralnego układu nerwowego
Wątroba	Komórki iPS	System dozowania nanolitrów	Alginate-RGD	Bioprinting ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich ukierunkowane różnicowanie w komórki podobne do hepatocytów w celu wytworzenia mini wątroby w 3D
Płuca	A549/HUVEC	BioFactory™	ECM Gel	Engineering an in vitro air-blood barrier by 3D bioprinting
Nerka	Immortalized PTECs/Primary RPTECs	In-House	Żelatyna/Fibryna	Bioprinting 3D zwiniętych kanalików proksymalnych nerek na perfuzyjnych chipach
Serce	HUVEC/Neonatal Cardiomyocytes	NovoGen MMX	Alginate/GelMA	Bioprinting 3D microfibrous scaffolds for engineering endothelialized myocardium and heart-on-a-chip
	Mezenchymalne komórki macierzyste/iPSC Derived Neurons	3D-BioPlotter®	Graphene/ PLGA	Trójwymiarowe drukowanie grafenowych rusztowań o wysokiej zawartości dla zastosowań elektronicznych i biomedycznych

Wnioski

Biodruk 3D pozwala na kontrolowane przestrzennie umieszczanie komórek w określonym mikrośrodowisku 3D. Biotusze są tworzone przez połączenie komórek i różnych biokompatybilnych materiałów, które są następnie drukowane w określonych kształtach w celu wygenerowania tkankowych struktur 3D. Łącząc nasze doświadczenie w materiałoznawstwie i biologii komórek, oferujemy różnorodne rozwiązania upraszczające proces biodruku 3D.

Referencje

1. Pan C, Bruyas A, Yang Y. 2016. Material Matters.. 11(2):49-55.

2. Sears NA, Seshadri DR, Dhavalikar PS, Cosgriff-Hernandez E. 2016. A Review of Three-Dimensional Printing in Tissue Engineering. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22(4):298-310. https://doi.org/10.1089/ten.teb.2015.0464

3. Langer R, Vacanti J. 1993. Tissue engineering. Science. 260(5110):920-926. https://doi.org/10.1126/science.8493529

4. Bose S, Vahabzadeh S, Bandyopadhyay A. 2013. Bone tissue engineering using 3D printing. Materials Today. 16(12):496-504. https://doi.org/10.1016/j.mattod.2013.11.017

5. Hutmacher DW. 2000. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials. 21(24):2529-2543. https://doi.org/10.1016/s0142-9612(00)00121-6

6. Bose S, Roy M, Bandyopadhyay A. 2012. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology. 30(10):546-554. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2012.07.005

7. Lichte P, Pape H, Pufe T, Kobbe P, Fischer H. 2011. Scaffolds for bone healing: Concepts, materials and evidence. Injury. 42(6):569-573. https://doi.org/10.1016/j.injury.2011.03.033

8. Lu L, Zhang Q, Wootton D, Chiou R, Li D, Lu B, Lelkes P, Zhou J. 2012. Biocompatibility and biodegradation studies of PCL/?-TCP bone tissue scaffold fabricated by structural porogen method. J Mater Sci: Mater Med. 23(9):2217-2226. https://doi.org/10.1007/s10856-012-4695-2

9. Elomaa L, Kang Y, Seppälä JV, Yang Y. 2014. Biodegradable photocrosslinkable poly(depsipeptide-co-?-caprolactone) for tissue engineering: Synthesis, characterization, and In vitro evaluation. J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem.. 52(23):3307-3315. https://doi.org/10.1002/pola.27400

10. Elomaa L, Pan C, Shanjani Y, Malkovskiy A, Seppälä JV, Yang Y. Three-dimensional fabrication of cell-laden biodegradable poly(ethylene glycol-co-depsipeptide) hydrogels by visible light stereolithography. J. Mater. Chem. B. 3(42):8348-8358. https://doi.org/10.1039/c5tb01468a

11. Yue K, Trujillo-de Santiago G, Alvarez MM, Tamayol A, Annabi N, Khademhosseini A. 2015. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73254-271. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.08.045