Hodowla organoidów 3D: Nowe modele rozwoju i chorób In Vitro

Read about

• 2D vs. Systemy modeli komórkowych 3D
• Czym są organoidy?
• Organoidy a sferoidy
• Jak powstają organoidy? Sferoidy
• Jak powstają organoidy?
• Applications of Organoids
• Related Organoid Cell Culture Products

Systemy modeli komórkowych 2D vs. 3D

Systemy modelowe napędzają badania biologiczne poprzez odtwarzanie procesów i funkcji organizmu od poziomu molekularnego do poziomu całego organizmu. Ciało ludzkie składa się zarówno z materiału komórkowego, jak i niekomórkowego zorganizowanego w wysoce wyspecjalizowany sposób. Trudno jest naśladować wszystkie aspekty ludzkiej biologii za pomocą jednego in vitro systemu modelowego.Hodowle komórkowe 3D są dokładniejszym odwzorowaniem naturalnego środowiska, którego doświadczają komórki w żywym organizmie, w przeciwieństwie do hodowli komórek na płaskich powierzchniach 2D.

.

Ograniczenia istniejącego systemu modeli komórkowych
Modele zwierzęce	Monowarstwy komórkowe 2D	3D Cell Aggregates
<.ul> Różnice w biologii ludzi i zwierząt Ograniczona użyteczność w obrazowaniu i badaniach o wysokiej przepustowości1 Wysoki koszt	Komórki tracą swój fenotyp Brak interakcji komórka-komórka i komórka-matryca Nie mogą naśladować funkcji komórkowych i ścieżek sygnalizacyjnych jak w warunkach in-vivo	Przejściowo przypominają organizację i interakcje komórek Trudne do utrzymania długoterminowe kultury Brak zdolności do samoodnowy i różnicowania2

Czym są organoidy?

Organoidy to in-vitro powstałe agregaty komórek 3D pochodzące z tkanki pierwotnej lub komórek macierzystych, które są zdolne do samoodnowy, samoorganizacji i wykazują funkcjonalność narządów.³ Organoidy rozwiązują ograniczenia istniejących systemów modelowych, zapewniając:

• Podobny skład i architekturę do tkanki pierwotnej: Organoidy zawierają niewielką populację samoodnawiających się komórek macierzystych, które mogą różnicować się w komórki wszystkich głównych linii komórkowych, z podobną częstotliwością jak w warunkach fizjologicznych.
• Relewantne modele in-vivo warunki: Organoidy są bardziej biologicznie istotne dla każdego systemu modelowego i są podatne na manipulowanie składnikami niszy i sekwencją genów.
• Stabilny system do rozszerzonej hodowli: Organoidy mogą być kriokonserwowane jako biobanki i rozszerzane w nieskończoność poprzez wykorzystanie samoodnowy, zdolności różnicowania komórek macierzystych i wewnętrznej zdolności do samoorganizacji.

Rysunek 1. Organoidy nabłonka jelitowego myszy. Organoidy 3D zostały wygenerowane z tkanki jelitowej dorosłych myszy zgodnie z protokołem opisanym przez Clevers et al. Science. 2013. Komórki organoidalne zaczynają tworzyć lumeny i struktury pąków około 3-5 dnia w hodowli i tworzą złożone struktury podobne do krypt około 7-10 dnia. Te kryptopodobne domeny są funkcjonalnie podobne do tych w dorosłym jelicie, gdzie dzielące się jelitowe komórki macierzyste LGR5+ są interkalowane z komórkami Paneth znajdującymi się u podstawy krypty.

Organoidy a sferoidy

Organoidy i sferoidy to komórki hodowane w 3 wymiarach. Sferoidy są często tworzone z linii komórek nowotworowych lub biopsji guza jako swobodnie pływające agregaty komórek w płytkach o bardzo niskim poziomie przyczepności, podczas gdy organoidy pochodzą z komórek macierzystych tkanek osadzonych w matrycy hydrożelowej ECM, takiej jak Matrigel. Organoidy są bardzo złożone i bardziej przypominają in vivo w porównaniu do sferoidów. Ostatnio wykazano, że organoidy nowotworowe pozwalają przewidzieć, jak dobrze pacjenci reagują na leki przeciwnowotworowe, aby pomóc w spersonalizowanej medycynie.

Rysunek 2. Organoidy a sferoidy. Organoidy pochodzące z komórek macierzystych mają bardziej zbliżone do żywych fenotypy z wyższym poziomem złożoności tkanek w porównaniu do sferoidów nowotworowych.

Jak generowane są organoidy?

Organoidy są generowane z pierwotnych tkanek lub pluripotencjalnych komórek macierzystych (indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) lub embrionalnych komórek macierzystych (ESC)) poprzez zapewnienie odpowiednich fizycznych i biochemicznych wskazówek⁴.

Wskazówki fizyczne: Zapewniają wsparcie dla przyczepienia i przetrwania komórek. Przykłady obejmują kolagen, fibronektynę, entaktynę i lamininę.

Wskazówki biochemiczne: Modulują szlaki sygnałowe, wpływając w ten sposób na proliferację, różnicowanie i samoodnowę. Przykłady obejmują EGF, FGF10, HGF, R-chondynę, WNT3A, kwas retinowy, inhibitory GSK3β, inhibitory TGF-β, inhibitory HDAC, inhibitory ROCK, Noggin, aktywinę A, inhibitory p38 i gastrynę.

Kwalifikowane odczynniki Organoid

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Zastosowania organoidów

Organoidy są fizjologicznie istotne i podatne na analizy molekularne i biologiczne komórek, co jest bardzo obiecujące zarówno w badaniach podstawowych, jak i zastosowaniach translacyjnych.  

Biologia rozwojowa

Organoidy pochodzące z ESC, iPSC zachowują cechy ich stadium rozwojowego i pomagają w badaniu procesu rozwoju embrionalnego, specyfikacji linii i homeostazy tkanek. Rzucają również światło na rozwój komórek macierzystych i ich nisz.

• Rozwój narządów takich jak mózg²⁴, trzustka²⁵ i żołądek⁷ był badany poprzez sekwencyjne etapy różnicowania indukowane przez modulowanie szlaków sygnałowych Wnt, BMP i FGF<< /li>

Patologia chorób zakaźnych

Organoidy reprezentują wszystkie składniki narządów i nadają się do badania chorób zakaźnych wpływających na wyspecjalizowane typy komórek ludzkich.

• Organoidy płucne pochodzące z iPSC od zdrowego dziecka niosącego zerowe allele genu czynnika regulacyjnego interferonu 7  stosowane do badania replikacji wirusa grypy ²⁶
  
• Organoidy przodomózgowia pochodzące z ludzkich iPSC zostały wykorzystane do badania infekcji wirusem zika na progenitorach neuronalnych²⁷

Medycyna regeneracyjna

Transplantacja organoidów pochodzących z dorosłych komórek macierzystych pomaga w zastąpieniu uszkodzonego narządu lub tkanki. Ponadto, możliwość korekcji genów za pomocą technologii CRISPR/Cas9 może być wykorzystywana w leczeniu monogenowych chorób dziedzicznych.

• Organy jelita cienkiego zachowały cechy jelita cienkiego, takie jak tworzenie kosmków i obecność kosmków Panetha po przeszczepieniu w modelach mysich²⁸

.Testowanie toksyczności i skuteczności leków

Możliwość testowania skuteczności i toksyczności leków przeciwko reprezentatywnym celom/organom (jelitom, wątrobie i nerkom) może potencjalnie ograniczyć kwestie etyczne związane z wykorzystaniem zwierząt.

• Organoidy nerkowe Hymana zostały wykorzystane do wykazania nefrotoksyczności cisplatyny ¹¹

Medycyna spersonalizowana

Organoidy pochodzące z dorosłych komórek macierzystych poszczególnych pacjentów umożliwiają testowanie ex vivo odpowiedzi na lek.

• Organoidy jelita grubego zostały wykorzystane do identyfikacji opcji leczenia dla pacjentów z rzadkimi mutacjami CFTR²⁹
  
• Organy nowotworowe mogą być stosowane do oceny odpowiedzi na leki na poziomie indywidualnego pacjenta

Rysunek 3. Generowanie organoidów z tkanek pierwotnych i pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz ich zastosowania.

Tabela 1.Podsumowanie czynników wzrostu i biochemicznych stosowanych w rozwoju różnych typów komórek organoidalnych.

Organoidy	Źródło	Warunki hodowli	Rodzaje komórek w organoidach	Odniesienia
Żołądek
	hPSCs	Indukcja endodermy:Inhibitor rocka (Y-27632), Activin A, BMP5 Generowanie sferoidów:WNT, FGF, Noggin, Kwas retinowy Tworzenie organoidów:.Noggin, kwas retinowy, EGF Dojrzewanie: EGF	Komórki LGR5+, komórki śluzowe, komórki endokrynne żołądka	7
	hAdSC	EGF, Rspondin, Noggin, FGF10, WNT, Gastryna, Nikotynamid oraz Inhibitor TGFβ	Komórki LGR5+, komórki śluzowe dołów, komórki śluzowe gruczołów, komórki główne i komórki enteroendokrynne	13
Jelito
	hPSC	Indukcja endodermy:Activin A, BMP4 Hindgut differentiation (spheroid generation): FGF4, WNT3A Organoid formation:FGF4, WNT3A Dojrzewanie:RSpondin1, Noggin, EGF, FGF4, WNT	Enterocyty, komórki kubkowe, Paneth i enteroendokrynne	30
	hAdSC	Powstanie:EGF, Rspondin, Noggin, WNT3A, Nikotynamid, Gastryna, inhibitor TGFβ, inhibitor p38 Differentiation : Without WNT3A, inhibitor kinazy MAP p38 i nikotynamid	Pochodne nabłonka jelitowego i komórki macierzyste	31
Colon
	hAdSC	Powstanie:EGF, Rspondin, Noggin, WNT3A, Nikotynamid, Gastryna, Inhibitor TGFβ, inhibitor p38 Różnicowanie: bez WNT3A, .inhibitor kinazy p38 MAP i nikotynamid	Komórki nabłonkowe i pochodne mezenchymalne	31
Wątroba
	hAdSC	Utworzenie:Noggin, WNT, InhibitorROCK Różnicowanie:Gastryna, EGF, Rspondin, FGF10, .czynnik wzrostu hepatocytów, nikotynamid, inhibitor TGFβ, forskolina	funkcjonalne komórki hepatocytów	14
	hiPSC	Indukcja endodermy:Activin A Specyfikacja wątroby: BMP4, FGF2, czynnik wzrostu hepatocytów Dojrzewanie: Oncostatin M	Funkcjonalne komórki hepatocytów	32
.Trzustka
	hAdSc	Ustalenie:Inhibitory TGFβ, Noggin, R-Spondin 1, WNT3A, EGF, FGF10, Nikotynamid Różnicowanie:Nie zgłoszono	Komórki nabłonka przewodowego	23
Prostate
	hAdSc	EGF, R-Spondin1, Noggin, inhibitor TGF-β, inhibitor kinazy p38 MAP, FGF10, FGF2, PGE2, Nikotynamid oraz DHT	Zróżnicowane CK5+ komórki podstawne i CK8+ komórki luminalne	17
Płuca
	hPSC	DHT	Komórki mezenchymalne i nabłonkowe płuc	33
Mózg
	hPSC	Indukcja neuronalna:suplement N2, NEAA i heparyna Różnicowanie:suplement N2, 2-merkaptoetanol, insulina Dojrzewanie:witamina A, kwas retinowy.	Populacje progenitorowe, które produkują dojrzałe neurony korowe	24
Kidney
	hPSC	Indukcja mezodermy pośredniej:Wnt, inhibitor GSK3α Tworzenie organoidów: inhibitor GSK3α, FGF9	Komórki nefronów i śródbłonka	11, 34

Powiązane produkty do hodowli komórek organoidalnych

Cultureware

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Enzymy

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Matryce organoidalne

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Linie komórkowe

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Podłoża i odczynniki hodowlane

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Czynniki wzrostu i cytokiny

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Małe cząsteczki

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Odczynniki histologiczne

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Referencje

1. Shanks N, Greek R, Greek J. 2009. Are animal models predictive for humans?. Philos Ethics Humanit Med. 4(1):2. https://doi.org/10.1186/1747-5341-4-2

2. Yin X, Mead B, Safaee H, Langer R, Karp J, Levy O. 2016. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18(1):25-38. https://doi.org/10.1016/j.stem.2015.12.005

3. Lancaster MA, Knoblich JA. 2014. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345(6194):1247125-1247125. https://doi.org/10.1126/science.1247125

4. Clevers H. 2016. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165(7):1586-1597. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.05.082

5. Eiraku M, Sasai Y. 2012. Self-formation of layered neural structures in three-dimensional culture of ES cells. Current Opinion in Neurobiology. 22(5):768-777. https://doi.org/10.1016/j.conb.2012.02.005

6. Nakano T, Ando S, Takata N, Kawada M, Muguruma K, Sekiguchi K, Saito K, Yonemura S, Eiraku M, Sasai Y. 2012. Self-Formation of Optic Cups and Storable Stratified Neural Retina from Human ESCs. Cell Stem Cell. 10(6):771-785. https://doi.org/10.1016/j.stem.2012.05.009

7. McCracken KW, Catá EM, Crawford CM, Sinagoga KL, Schumacher M, Rockich BE, Tsai Y, Mayhew CN, Spence JR, Zavros Y, et al. 2014. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516(7531):400-404. https://doi.org/10.1038/nature13863

8. Wong AP, Bear CE, Chin S, Pasceri P, Thompson TO, Huan L, Ratjen F, Ellis J, Rossant J. 2012. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat Biotechnol. 30(9):876-882. https://doi.org/10.1038/nbt.2328

9. Huang SXL, Islam MN, O'Neill J, Hu Z, Yang Y, Chen Y, Mumau M, Green MD, Vunjak-Novakovic G, Bhattacharya J, et al. 2014. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32(1):84-91. https://doi.org/10.1038/nbt.2754

10. Takebe T, Sekine K, Enomura M, Koike H, Kimura M, Ogaeri T, Zhang R, Ueno Y, Zheng Y, Koike N, et al. 2013. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499(7459):481-484. https://doi.org/10.1038/nature12271

11. Takasato M, Er PX, Chiu HS, Maier B, Baillie GJ, Ferguson C, Parton RG, Wolvetang EJ, Roost MS, Chuva de Sousa Lopes SM, et al. 2015. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526(7574):564-568. https://doi.org/10.1038/nature15695

12. Sato T, Clevers H. 2013. Growing Self-Organizing Mini-Guts from a Single Intestinal Stem Cell: Mechanism and Applications. Science. 340(6137):1190-1194. https://doi.org/10.1126/science.1234852

13. Bartfeld S, Bayram T, van de Wetering M, Huch M, Begthel H, Kujala P, Vries R, Peters PJ, Clevers H. 2015. In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection. Gastroenterology. 148(1):126-136.e6. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2014.09.042

14. Huch M, Gehart H, van Boxtel R, Hamer K, Blokzijl F, Verstegen M, Ellis E, van Wenum M, Fuchs S, de Ligt J, et al. 2015. Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell. 160(1-2):299-312. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.11.050

15. Huch M, Dorrell C, Boj SF, van Es JH, Li VSW, van de Wetering M, Sato T, Hamer K, Sasaki N, Finegold MJ, et al. 2013. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494(7436):247-250. https://doi.org/10.1038/nature11826

16. Huch M, Bonfanti P, Boj SF, Sato T, Loomans CJM, van de Wetering M, Sojoodi M, Li VSW, Schuijers J, Gracanin A, et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO J. 32(20):2708-2721. https://doi.org/10.1038/emboj.2013.204

17. Karthaus W, Iaquinta P, Drost J, Gracanin A, van Boxtel R, Wongvipat J, Dowling C, Gao D, Begthel H, Sachs N, et al. 2014. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159(1):163-175. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.08.017

18. Linnemann JR, Miura H, Meixner LK, Irmler M, Kloos UJ, Hirschi B, Bartsch HS, Sass S, Beckers J, Theis FJ, et al. 2015. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142(18):3239-3251. https://doi.org/10.1242/dev.123554

19. Maimets M, Rocchi C, Bron R, Pringle S, Kuipers J, Giepmans B, Vries R, Clevers H, de Haan G, van Os R, et al. 2016. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6(1):150-162. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2015.11.009

20. Nanduri L, Baanstra M, Faber H, Rocchi C, Zwart E, de Haan G, van Os R, Coppes R. 2014. Purification and Ex Vivo Expansion of Fully Functional Salivary Gland Stem Cells. Stem Cell Reports. 3(6):957-964. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2014.09.015

21. DeWard A, Cramer J, Lagasse E. 2014. Cellular Heterogeneity in the Mouse Esophagus Implicates the Presence of a Nonquiescent Epithelial Stem Cell Population. Cell Reports. 9(2):701-711. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2014.09.027

22. Mondrinos MJ, Jones PL, Finck CM, Lelkes PI. 2014. Engineering De Novo Assembly of Fetal Pulmonary Organoids. Tissue Engineering Part A. 20(21-22):2892-2907. https://doi.org/10.1089/ten.tea.2014.0085

23. Boj S, Hwang C, Baker L, Chio I, Engle D, Corbo V, Jager M, Ponz-Sarvise M, Tiriac H, Spector M, et al. 2015. Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer. Cell. 160(1-2):324-338. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.12.021

24. Lancaster MA, Renner M, Martin C, Wenzel D, Bicknell LS, Hurles ME, Homfray T, Penninger JM, Jackson AP, Knoblich JA. 2013. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501(7467):373-379. https://doi.org/10.1038/nature12517

25. Greggio C, De Franceschi F, Figueiredo-Larsen M, Gobaa S, Ranga A, Semb H, Lutolf M, Grapin-Botton A. 2013. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140(21):4452-4462. https://doi.org/10.1242/dev.096628

26. Ciancanelli MJ, Huang SXL, Luthra P, Garner H, Itan Y, Volpi S, Lafaille FG, Trouillet C, Schmolke M, Albrecht RA, et al. 2015. Life-threatening influenza and impaired interferon amplification in human IRF7 deficiency. Science. 348(6233):448-453. https://doi.org/10.1126/science.aaa1578

27. Fukuda M, Mizutani T, Mochizuki W, Matsumoto T, Nozaki K, Sakamaki Y, Ichinose S, Okada Y, Tanaka T, Watanabe M, et al. 2014. Small intestinal stem cell identity is maintained with functional Paneth cells in heterotopically grafted epithelium onto the colon. Genes Dev.. 28(16):1752-1757. https://doi.org/10.1101/gad.245233.114

28. Dekkers JF, Wiegerinck CL, de Jonge HR, Bronsveld I, Janssens HM, de Winter-de Groot KM, Brandsma AM, de Jong NWM, Bijvelds MJC, Scholte BJ, et al. 2013. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19(7):939-945. https://doi.org/10.1038/nm.3201

29. Spence JR, Mayhew CN, Rankin SA, Kuhar MF, Vallance JE, Tolle K, Hoskins EE, Kalinichenko VV, Wells SI, Zorn AM, et al. 2011. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470(7332):105-109. https://doi.org/10.1038/nature09691

30. Sato T, Stange DE, Ferrante M, Vries RG, van Es JH, van den Brink S, van Houdt WJ, Pronk A, van Gorp J, Siersema PD, et al. 2011. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141(5):1762-1772. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2011.07.050

31. Si-Tayeb K, Noto FK, Nagaoka M, Li J, Battle MA, Duris C, North PE, Dalton S, Duncan SA. 2010. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51(1):297-305. https://doi.org/10.1002/hep.23354

32. Dye BR, Hill DR, Ferguson MA, Tsai Y, Nagy MS, Dyal R, Wells JM, Mayhew CN, Nattiv R, Klein OD, et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. 4 https://doi.org/10.7554/elife.05098

33. Takasato M, Er PX, Chiu HS, Little MH. 2016. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 11(9):1681-1692. https://doi.org/10.1038/nprot.2016.098