Test penetracji przeciwciał przez barierę krew-mózg przy użyciu płytek mikrostudzienkowych Millicell®
Co to jest bariera krew-mózg?
Bariera krew-mózg (BBB) to bariera ochronna, która oddziela centralny układ nerwowy od związków znajdujących się w krążącej krwi. Umożliwia ona lub blokuje przedostawanie się pewnych substancji we krwi, takich jak przeciwciała, do ludzkiego mózgu. Ponieważ zapobiega ona przedostawaniu się cząsteczek do mózgu, kluczowe znaczenie ma projektowanie leków, przeciwciał i immunoterapii, które są ukierunkowane na komórki w mózgu i mogą przechodzić przez BBB.
Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie bariery krew-mózg.
Terapia przeciwciałami stała się ważnym nowym narzędziem w neuronauce, neuro-onkologii i immunoterapii. Te immunoterapie działają poprzez celowanie w antygeny powierzchniowe, które ulegają ekspresji na guzach nowotworowych i wyzwalają odpowiedź immunologiczną organizmu1. Jednak system BBB jest trudny do naśladowania in vitro i często jest badany przy użyciu modeli zwierzęcych.
Tutaj demonstrujemy skalowalny i wysokowydajny test wykorzystujący BBB assembloids i Millicell® Microwell 96-dołkowe płytki in vitro. Nasze wielokomórkowe modele BBB są wysoce powtarzalnymi assembloidami składającymi się z komórek śródbłonka mózgu, astrocytów i perycytów i opierają się na samoagregacji. Metoda ta pozwala na bezpośrednie interakcje między komórkami, ściśle modelując właściwości BBB in vivo.
Rysunek 2.Reprezentacja modeli BBB in vitro.
Atrybuty płytek mikrostudzienkowych Millicell®
Płytki 96-studzienkowe Millicell® Microwell są gotowym do użycia narzędziem, które zapewnia wysoką i niezawodną hodowlę 3D. Płytki nie wymagają zewnętrznej stałej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), ponieważ mikrodołki w płytce zawierają hydrożel glikolu polietylenowego (PEG), który jest oparty na wodzie i sprzyja mniejszej dyfrakcji podczas obrazowania. Hydrożel PEG pozwala na łatwe wysiewanie komórek i opracowywanie testów. Płytki mikrostudzienkowe Millicell® zawierają również port wymiany mediów z dala od mikrostudzienek, dzięki czemu użytkownicy mogą łatwo wymieniać media bez utraty mikrotkanek.
Sferoidy lub organoidy zasiane w mikrostudzienkach tworzą pojedynczą płaszczyznę ogniskową i mogą być skalowane w celu łatwego wdrożenia zautomatyzowanych, wysokowydajnych aplikacji do obrazowania i badań przesiewowych. Ponieważ BBB assembloidy zostały wygenerowane w 96-dołkowych płytkach Millicell® Microwell, nastąpił 55-krotny wzrost wydajności organoidów, z ponad 5000 punktów danych na pojedynczej 96-dołkowej płytce w porównaniu z bardziej tradycyjnymi metodami hodowli zawiesinowej. Organoidy również ściśle odzwierciedlają architekturę BBB in vivo, a tym samym stanowią idealny model do wysokowydajnych testów penetracji przeciwciał.
Jak wybrać płytkę 96-dołkową Millicell®?/h2>
Istnieją dwa standardowe projekty dla różnych rozmiarów mikrostudzienek w studzienkach płytek 96-dołkowych Millicell® Microwell. Dodanie mikrostudzienek pozwala na skalowanie generowania organoidów w zależności od zastosowania:
Rysunek 3.Schematyczne przedstawienie mikrostudzienek/dołka dla każdego rozmiaru mikrostudzienki.
Protokół penetracji przeciwciał do bariery krew-mózg
- Wprowadź linie komórkowe śródbłonka, perycytów i astrocytów jednocześnie do 96-dołkowej płytki Millicell® Microwell o pojemności 600 mikrostudzienek.
- Dodaj media hodowlane przez port wymiany mediów.
- Pozwól asembloidom na samoorganizację, zagęszczenie, wzrost i pełny rozwój w ciągu 48 godzin.
- Zrób zdjęcie z dna 96-dołkowych płytek Millicell® Microwell, aby monitorować rozmiar, okrągłość i żywotność asembloidów.
- Inkubuj asembloidy z przeciwciałami, aby monitorować penetrację przeciwciał do asembloidów.W tym teście przeciwciała oceniane pod kątem penetracji były inkubowane do 6 godzin.
- Utrwalanie i immunobarwienie na płytce Millicell® Microwell. W tym protokole użyto DAPI (jądro), P-gP (komórki śródbłonka), NG2 (perycyty) i GFAP (astrocyty), a śmierć komórek monitorowano za pomocą Calcein-AM i heterodimeru Eth.
- Oceń penetrację przeciwciał za pomocą pośredniej immunofluorescencji za pomocą mikroskopu konfokalnego.
Wyniki penetracji przeciwciał przez barierę krew-mózg
Używając 96-dołkowych płytek Millicell® Microwell, BBB assembloidy samoorganizowały się w odrębne warstwy. Zostało to zwizualizowane poprzez obecność specyficznych markerów dla każdego typu komórek, które zostały wykryte bezpośrednio na płytkach Millicell® Microwell. W asembloidach BBB komórki śródbłonka (P-gP) otaczają perycyty (NG2), które otaczają rdzeń astrocytów (GFAP) (Rysunek 5).
Rysunek 4.Obrazowanie organoidów BBB na płytce Millicell® Microwell. A. Obrazowanie Brightfield jednego dołka płytki Millicell® Microwell z 55 asembloidami BBB. B. Barwienie żywych/umarłych organoidów BBB. Pasek skali 600 μm.
Rysunek 5.Immunofluorescencja warstw organoidu BBB. DAPI (jądro), P-gP (komórki śródbłonka), NG2 (perycyty) i GFAP (astrocyty). Pasek skali 50 μm.
Barwienie immunologiczne można było bezpośrednio określić ilościowo dla każdej linii komórkowej w warstwach poprzez obrazowanie wykonane bezpośrednio na 96-dołkowych płytkach Millicell® Microwell. Przeciwciała przeniknęły przez wielokomórkowe warstwy organoidów, a ten nowy system organoidów pozwolił na bezpośrednie interakcje komórka-komórka, podobne do tych, które występują w BBB in vivo.
Rysunek 6.Immunofluorescencja i kwantyfikacja penetracji przeciwciał przez asemblony BBB. A. nieleczona kontrola; B. Niecelowana ludzka IgG, komórki śródbłonka znakowano anty-P-gP; C. Ludzki prom mózgowy. Pasek skali 100 μm; D) Kwantyfikacja penetracji przeciwciał poprzez intensywność fluorescencji.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?