Tormaperoxidáz (HRP) enzimek

Tormaperoxidázunkat kifejezetten a tormagyökérből válogatjuk és termesztjük, és termelőink folyamatosan, hosszú évek óta alkalmazzák a minőséget, a konzisztenciát és az optimális hozamot biztosító folyamatfejlesztéseket. A peroxidázt évtizedek óta több kilogrammos tételméretekben állítjuk elő St. Louis-i ISO 9001:2000 szabvány szerinti gyártóüzemünkben. Míg a világ más részein a tormakínálat problémás volt, addig az észak-amerikai tormakínálat erősödött. St. Louis-i termelőüzemünk a Mississippi völgyének American Bottoms néven ismert területére néz, ahol a világ tormájának 60%-át termelik.

A termelőüzem tapasztalt, jól képzett munkaerővel rendelkezik, amely a feldolgozás, a berendezések, a tisztítás, a tesztelés és a csomagolás műveleteinek szigorú működési eljárásait követi a megbízható minőségügyi és minőségbiztosítási rendszereken belül.

A peroxidázunkat világszerte elismert ipari szabványként tartják számon a diagnosztikai gyártás és a laboratóriumi szintű kutatási alkalmazások területén. A tisztaság, az izoforma-tartalom és a kovalens módosítások alapján számos terméket kínálunk, hogy megfeleljen a bevett alkalmazásoknak és az alapkutatási igényeknek egyaránt.

Bővebben

• Tormaperoxidáz funkció és aktivitás/a>
• A natív torma-peroxidáz termékjellemzői

Tormaperoxidáz működése és aktivitása

A specifikus aktivitás a pirogallol egységekben van kifejezve. Egy pyrogallol egység 20 másodperc alatt 1,0 mg purpurogallint képez pirogallolból pH 6,0-nál, 20 °C-on, hacsak a felsorolásban másként nem szerepel. Ez a purpurogallin (20 sec) egység kb. 18 µM egységnek felel meg percenként 25° C-on.

ABTS egységek egy másik gyakran használt egységdefiníció. Egy ABTS egység percenként 1 µmol ABTS-t oxidál 25 °C-on, pH 5,0 mellett. Az ABTS-t szubsztrátként használva kb. négyszer nagyobb aktivitás figyelhető meg a pirogallol rendszerhez képest.

A RZ (Reinheitszahz) az A₄₀₃/A₂₇₅/A₂₇₅ abszorbanciahányados, amelyet 0,5-1,0 mg/ml koncentrációban, deionizált vízben határoznak meg. Ez a hemin-tartalom mérőszáma, és nem feltétlenül jelzi az enzimatikus aktivitást.

A natív torma-peroxidáz termékjellemzői

Extinkciós együttható: E_mM = 100, 403 nm-en mérve.¹

Molekulatömeg: (kb. 44 kDa)

A polipeptidláncot (33 890 Dalton), hemin plusz Ca²⁺ (kb. 700 Dalton), és szénhidrát (9400 Dalton).³

Isoelektromos pont: Az izoenzimek 3,0 - 9,0 között mozognak

A HRP-nek legalább hét izoenzimje létezik.²

A torma-peroxidáz (HRP) a torma gyökeréből (Amoracia rusticana) izolált, és a peroxidázok ferroprotoporfirin csoportjába tartozik. A HRP egy egyláncú polipeptid, amely négy diszulfidhidat tartalmaz. Ez egy 18% szénhidrátot tartalmazó glikoprotein. A szénhidrát-összetétel galaktózból, arabinózból, xilózból, fukózból, mannózból, mannozaminból és galaktozaminból áll, a specifikus izoenzimtől függően.²

Szubsztrátspecifikusság

AHRP könnyen egyesül a hidrogén-peroxiddal (H₂O<₂), és a keletkező [HRP-H₂2O₂] komplex képes a legkülönbözőbb kromogén hidrogéndonorok oxidálására. Emellett kemilumineszcens szubsztrátokat, például luminolt és izoluminolt, valamint fluorogén szubsztrátokat, például tiramint, homovanillinsavat és 4-hidroxifenil-ecetsavat is képes felhasználni.

A Enzyme Explorer's Substrate Index számos kromogén és kemilumineszcens hidrogéndonorhoz nyújt linkeket, amelyeket a peroxidáz aktivitás vizsgálatához használnak.

Inhibitorok

Az alábbi vegyületek a torma-peroxidáz inhibitorai a torma-peroxidáznak: nátrium-azid, cianid, L-cisztin, dikromát, etilén-tiokarbamid, hidroxilamin, szulfid, vanadát, p-aminobenzoesav, Cd^{+2<./sup>, Co+2, Cu+2, Fe+3, Mn+2, Ni+2, Pb+2.4}

pH-függőség

A HRP pH-optimumát a 6,0 és 6,5 közötti tartományban határozza meg. Az aktivitás pH 7,5-nél a maximum 84%-át éri el. Az enzim az 5,0 és 9,0 közötti pH-tartományban a legstabilabb.⁵

Alkalmazások

A torma-peroxidázt széles körben használják immunglobulinok jelölésére számos különböző immunkémiai alkalmazásban, beleértve az ELISA-t, az immunoblottingot és az immunhisztokémiát. A HRP többféle módszerrel konjugálható antitestekhez, beleértve a glutaraldehidet, a periodátoxidációt, a diszulfidkötéseket, valamint az amino- és tiol-irányított keresztkötéseket. A HRP az antitestek legkeresettebb jelölője, mivel a három legnépszerűbb enzimjelölő (HRP, alkalikus foszfatáz és B-galaktozidáz) közül a legkisebb és legstabilabb, és glikozilációja alacsonyabb nem specifikus kötődést eredményez.⁶ A glutaraldehid és periodát konjugációs módszereket leíró protokollok áttekinthetők Harlow, E. et al-ban.⁷

Az blotting, szövettani és ELISA alkalmazásokhoz számos kromogén és kemilumineszcens detektáló reagens kínálunk.

A HRP-konjugált antitestek teljes sorát is kínáljuk.

Készítési útmutató

Az oldószer kiválasztása a tervezett alkalmazástól függ. A porított enzimek vízben vagy 0,1 M foszfátpufferben, pH 6-ban oldódnak (10 mg/ml). A szuszpenzió (P6140) vízben hígítható.

Tárolás/Szabályozhatóság

A porított peroxidázokat 2-8 °C-on hűtve kell tárolni. A fagyasztva tárolás is elfogadható, de nem szükséges. A szuszpenziót (P6140) 2-8 °C-on kell tárolni. Megfelelő tárolás esetén ezek a termékek legalább két évig eltarthatók.

RZ profil

RZ (Reinheitszahl): A₄₀₃/A₂₇₅ abszorbanciaaránya. Ez a peroxidáz hemin-tartalmának, nem pedig az enzimaktivitásnak a mérőszáma. Még a magas RZ-értékkel rendelkező készítmények is rendelkezhetnek alacsony enzimaktivitással. Fehérjék, például antitestek peroxidázzal való konjugálásához olyan peroxidázt válasszon, amelynek RZ-értéke legalább 3,0.

Hivatkozások

1. DELINCEE H, RADOLA BJ. 1975. Fractionation of Horseradish Peroxidase by Preparative Isoelectric Focusing, Gel Chromatography and Ion-Exchange Chromatography. Eur J Biochem. 52(2):321-330. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1975.tb04000.x

2. Shannon LM, Kay E, Lew JY. 1966. Peroxidase Isozymes from Horseradish Roots. Journal of Biological Chemistry. 241(9):2166-2172. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)96680-9

3. WELINDER KG. 1979. Amino Acid Sequence Studies of Horseradish Peroxidase. Amino and Carboxyl Termini, Cyanogen Bromide and Tryptic Fragments, the Complete Sequence, and Some Structural Characteristics of Horseradish Peroxidase C. Eur J Biochem. 96(3):483-502. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1979.tb13061.x

4. Zollner H. 1993. Handbook of Enzyme Inhibitors. 2nd Ed., Part A: 367–368.

5. Schomberg, D, Salzmann, M, and Stephan, D. 1993. Enzyme Handbook 7, EC 1.11.1.7:1–6.

6. Deshpande SS. 1996. Enzyme Immunoassays. https://doi.org/10.1007/978-1-4613-1169-0

7. Harlow, E, and Lane, D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual, pp. 346–348 . Cold Spring Harbor Laboratory, .