Fehérjemeghatározás bicinkoninsav (BCA) módszerrel

cél

Megadni egy standard eljárást az oldatok teljes fehérjekoncentrációjának mennyiségi meghatározására a BCA-módszerrel.

KÖZLTSÉGVIZSGÁLAT

Ez a protokoll minden olyan szabályozott termékre vonatkozik, amelynél a fehérjeelemzést a BCA-módszerrel kell elvégezni.

Megbeszélés

A fehérjék a lúgos Cu (II)-t koncentrációfüggő módon Cu (I)-vé redukálják. A bicinkoninsav a Cu (I)-re igen specifikus kromagén reagens, amely 562 nm-en abszorbancia maximummal rendelkező komplexet képez. E tulajdonsága miatt az 562 nm-en mért abszorbancia egyenesen arányos a fehérje koncentrációjával. Fehérje standardként szarvasmarha szérumalbumin szolgál.

MEGHATÁROZÁSOK

N/A

FELELŐSSÉGEK

N/A

MÓDSZER

ELJÁRÁS

/h2>

Reagens

• BicinchoninicAcid oldat, termékszáma. B9643.
• Réz(II)-szulfát-pentahidrát 4%-os oldat, terméksz. C2284.
• Protein standard oldat, 1.0 mg/ml szarvasmarha szérumalbumin (BSA), termékszám:  P0914.
• Vizsgálati minták

MEGJEGYZÉS: Más BSA is használható standardként. Ha azonban 1 mg/ml-re kell hígítani, a fehérje koncentrációját a 280 nm-en mért abszorbanciával kell megerősíteni, E^1%₂₈₀ = 6,67 használatával. A mintáknak 0,2 - 10 mg/ml fehérje között kell lenniük, hogy a vizsgálat lineáris tartományában maradjanak. Vízzel való hígításra lehet szükség ahhoz, hogy a tartományba essen.

Műszerek

• Spektrofotométer, Uvikon 943 vagy azzal egyenértékű.
• Pipetta/csúcsok
• Vizsgálati csövek
• Vizsgálati cső állvány
• Eldobható küvetták, termékszáma: Sz. C5416, vagy azzal egyenértékű.
• Inkubátorok, Imperial III, vagy azzal egyenértékű.

Védelmi óvintézkedések

A kémiai veszélyek és a megfelelő kezelési óvintézkedések tekintetében olvassa el az anyagbiztonsági adatlapokat (MSDS).

Módszer

1. Készítse el a fehérje meghatározó reagensét I ml Réz(II)szulfát-pentahidrát 4%-os oldat (C2284) 49 ml Bicinkoninsav oldat (B9643) 49 ml-hez.

2. Kvantitatív módon adja a jelzett mennyiségű vizet és fehérje standardot a jelzett csövekbe.

cső	mL víz	mL fehérje standard
1	0.5	0
2	0.3	0.2
3	0.2	0.3
4	0.1	0.4
5	0.0	0.5

3. Készítse elő a reakciócsöveket az alábbiak szerint: A mintákat két példányban kell elkészíteni.

Tubus	mL fehérje standard	mL minta vagy kontroll	mg/ml fehérje	mL fehérje meghatározó reagens
1	1	-	0	2.0
2	0.1	-	0.4	2.0
3	0.1	-	0.6	2.0
4	0.1	-	0.8	2.0
5	0.1	-	1.0	2.0
6	-	0.1	?	2.0
7	-	0.1	?	2.0

4. A megfelelő keveredés biztosítása érdekében minden egyes csövet vortexeljen.

5. Inkubáljuk a csöveket 37 °C-on 30 percig.

6. Az abszorbancia mérése előtt hagyjuk a csöveket szobahőmérsékletre hűlni.

7. Ürítse ki a spektrofotométert vízzel szemben. Mérjük meg a standardok (1-6. csövek) abszorbanciáját 562 nm-en.

8. A standardok ismert fehérjekoncentrációját használjuk a standardgörbe elkészítéséhez. Ha az adatpontok jelentős eltérést mutatnak a standardgörbe vonalától, konzultáljon a tanszéki felügyelettel. A vonal meredekségének körülbelül 1,0-nak kell lennie.

9. Olvassuk le a minták abszorbanciáját 562 nm-en. A standardgörbe segítségével számítsa ki a fehérjekoncentrációt mg/ml-ben.

10. A végső fehérjekoncentrációhoz szorozzuk meg a hígítási tényezővel, amely szükséges volt ahhoz, hogy a koncentráció a vizsgálat lineáris tartományába kerüljön. A jelentéshez átlagolja a minta eredményeit.

11. Töltse ki a megfelelő munkalapot.