Fordított fázisú kromatográfia (RPC) a gyakorlatban

Szakasz áttekintése

• Média és oszlopok kiválasztása
• Eluens kiválasztása és előkészítése

A fordított fázisú kromatográfiát (RPC) biológiai molekulák, köztük fehérjék, peptidek, antitestek és egyéb metabolitok tisztítására, elválasztására és elemzésére használják. A kémiai szintézisfolyamatok közbenső és végtermékeinek elválasztására és tisztítására is alkalmazzák.

A RPC több típusát foglalja magában, beleértve a fordított fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát, a fordított fázisú ultranagy teljesítményű folyadékkromatográfiát, a fordított fázisú vékonyréteg-kromatográfiát és a fordított fázisú szilárd fázisú extrakciót. A fordított fázisú kromatográfia a partíciós kromatográfia elvein alapul, ahol a vegyületek elválasztása az állófázissal és a mozgófázissal való kölcsönhatásuk alapján történik.

Egy tipikus fordított fázisú oszlop állófázisa szilícium-dioxid hordozó, amelynek felületéhez hidrofób csoportok kapcsolódnak.

A gyakorlatban egy tipikus RPC elválasztás lépései a 1. ábra szerint foglalhatók össze.

A 1. ábra szerint.

1. ábra. Tipikus RPC elválasztás gradiens elúcióval.

Az elméleti részben tárgyaltak szerint a sikeres RPC szétválasztást számos paraméter befolyásolja, és mindig az alkalmazás követelményeinek megfelelően kell optimalizálni. A biomolekulák RPC elválasztásához szükséges közegek és feltételek kiválasztásának és optimalizálásának lépései a következő sorrendben szerepelnek:

1. Válasszunk olyan közeget, amely a legegyszerűbb kiindulási körülmények között a legjobb felbontást biztosítja, például TFA és acetonitril az eluensben (a fehérjék és peptidek szelektivitása alig különbözik egymástól, ha szilícium-dioxid- vagy polimeralapú közeget használunk ilyen körülmények között).
2. Keresze ki a legjobb felbontást biztosító pH-t. Ez lehet az a kulcstényező, amely meghatározza, hogy szilika- vagy polimeralapú közeget használjunk-e.
3. Szükség esetén keressünk megfelelő ionpárosítót a szelektivitás javítása érdekében.
4. Optimalizáljuk a gradiens elúciót a szelektivitás maximalizálása érdekében (a gradiens meredeksége csak a csúcsok közötti távolságot befolyásolja, nem változtatja meg az elúciós sorrendjüket). Válassza ki a legmeredekebb gradienst (legkisebb gradiens térfogat), amely elfogadható eredményt ad.
5. Keresze ki a legnagyobb áramlási sebességet, amely elfogadható elválasztást biztosít.

Médium és oszlop kiválasztása

A megfelelő RPC-médium és oszlopméretek kiválasztása kritikus fontosságú a sikeres elválasztás szempontjából, és az alkalmazás célja és a mintakomponensek jellege alapján kell kiválasztani.

Mintakomponensek: hidrofóbitás

Az RPC közeg kiválasztását a mintakomponensek hidrofóbságának függvényében empirikusan kell elvégezni. Más kromatográfiás technikáktól eltérően szinte lehetetlen megjósolni a biomolekulák visszatartását az RPC-ben. Úgy tűnik, hogy a peptid visszatartását befolyásoló fontos paraméterek a peptid aminosav-szekvenciájának és a másodlagos szerkezetnek, például az α-hélixeknek és a β-lapoknak a kombinációja. A fehérjék esetében a helyzetet tovább bonyolítja a tercier szerkezetük.

Az elúció megkönnyítése érdekében válasszunk kevésbé hidrofób közeget, ha olyan komponenseket választunk szét, amelyekről ismert, hogy erősen hidrofóbok. Az erősen kötődő minták könnyebben eluálódnak egy kevésbé hidrofób közegből.

A szétválasztás célja

A többkomponensű minták frakcionálásával járó alkalmazások, mint például a peptidtérképezés, rendkívül nagy felbontást igényelnek. A preparatív fordított fázisú alkalmazások, mint például a szintetikus peptidek tisztítása, inkább az áteresztőképességet tartják szem előtt, és a felbontást a sebesség és a kapacitás ellenében lehet felcserélni. Ha azonban a végső polírozási lépésben használják, a felbontás döntő fontosságú.

A felbontás a fordított fázisú kromatográfiában az oszlop hatékonyságától és a szelektivitástól függ. A szelektivitást jelentősen befolyásoló paramétereket e fejezetben korábban tárgyaltuk.

Ahol csak lehetséges, kereskedelmi forgalomban kapható előrecsomagolt oszlopokat használjunk, mivel a maximális hatékonyság a csomagolási eljárástól és a közeg részecskeméretétől függ. A legkisebb, 3 μm-es részecskék adják a legnagyobb hatékonyságot, amelyet a nagyobb, 5 μm-es közegek követnek, mint például a SOURCE™ 5RPC és így tovább.

A szétválasztás skálája

Mikropreparatív és analitikai elválasztásokhoz 3 μm (μRPC C2/C18) vagy 5 μm (SOURCE™ 5RPC) részecskékkel töltött oszlopokat használjon.

Az 5 μm-es vagy 15 μm-es hordozókat laboratóriumi léptékű elválasztások köztes tisztításához vagy polírozásához használja. A 15 μm-es hordozó jobban alkalmas nyers mintákhoz.

Nagyméretű preparatív és technológiai elválasztásokhoz 15 μm-es vagy 30 μm-es hordozókat használjon, például SOURCE™ 15RPC vagy SOURCE™ 30RPC. Ezek a közegek kisebb nyomásigényt kínálnak nagy áramlási sebesség mellett, és úgy lettek optimalizálva, hogy nagy áteresztőképességet (meghatározott idő alatt feldolgozott minta mennyisége) biztosítsanak, miközben megmarad a nagy teljesítmény. A SOURCE™ 30 RPC ideális az ipari folyamatok polírozási szakaszához.

Megjegyzendő, hogy az RPC elválasztások természetéből adódóan a részecskeméret változtatásakor a szelektivitás kismértékű változása következhet be.

Elúziós feltételek

Ha a kezdeti szelektivitás vagy a minta stabilitási és oldhatósági tényezői pH 7 feletti eluens használatát jelzik.5, mindig polimer alapú hordozót használjon, mint például a SOURCE™ RPC.

A nyers fehérje- vagy peptidmintákkal való munka során előnyös olyan polimer alapú hordozókat használni, amelyek lúggal könnyen tisztíthatók (a szilícium-dioxid alapú hordozók pH 7,5 felett feloldódnak).

Oszlophossz

Az oszlophossz növelése javíthatja a felbontást, ha nagy mintamennyiségekkel dolgozunk.

A hosszabb oszlophossz javíthatja a felbontást egy összetett peptidkeverékben, például a peptidek felbontását egy peptidemésztésből.

A hosszabb oszlophossz javíthatja a szorosan összefüggő peptidek vagy fehérjék felbontását, ha a szerves módosítószer sekély gradiensét használják.

Eluens kiválasztása és előkészítése

Ahol csak lehetséges, a legnagyobb tisztaságú, HPLC minőségű oldószereket, savakat, bázisokat, sókat, ionpárosító szereket és vizet használjon. A kémiai tisztaság fontos, mivel a szennyeződések nem kívánt extra csúcsokat, szellemcsúcsokat hozhatnak létre, vagy szennyezhetik a végterméket.

Minden komponensnek 220 nm alatti UV tartományban átlátszónak kell lennie, és oldhatónak kell lennie az elválasztás során alkalmazott alacsony polaritású körülmények között. Bár a fehérjék 280 nm-en, a szintetikus oligonukleotidok pedig 250-260 nm-en abszorbeálnak, a 220 nm alatti (általában 215 nm-en történő) detektálás szükséges az olyan rövid peptidek elválasztásakor, amelyekből hiányoznak az aromás aminosavmaradékok, mint például a Trp és Tyr. A 18. és 19. táblázatban ajánlott komponenseket az alapján választottuk ki, hogy alacsony háttérabszorbancia mellett optimális elválasztást biztosítsanak.

Ahol lehetséges, használjunk illékony komponenseket. Ezek a szerves módosítóval együtt elpárologtatással eltávolíthatók az eluált frakciókból. A nem illékony sókat vagy savakat egy további sótalanítási lépéssel kell eltávolítani.

pH és ionpárosító szerek

Mivel a fehérjék és peptidek nettó töltése a pH-val változik, a nettó hidrofóbitásuk is változik a pH-val. Az eluens pH-értéke ezért jelentősen befolyásolja az eluálás sorrendjét és a végső szelektivitást.

Ismeretlen tulajdonságú minták esetében kezdjük a leggyakrabban használt erős savval, amely ionpárosító szerként is működik: 0,1%-os trifluorecetsav mint A eluens (csökkentsük 0,065%-ra, ha az alapvonal stabilitását javítani kell).

Adjunk ionpárosító szereket olyan koncentrációban, hogy a hidrofób komponensek kötődése a közeghez fokozódjon. Vegye figyelembe, hogy más ionpárosító szerek nem kombinálhatók TFA-val.

Szilícium-dioxid-alapú közegek esetén használjon ionpárosító szereket a vegyes módú visszatartás (100. oldal) minimalizálása érdekében, amely ronthatja a felbontást.

Az ionpárosító szerek jelenléte befolyásolhatja az UV-abszorbanciát, és a szerves módosítószer koncentrációjának változásával változások figyelhetők meg. Ez emelkedő vagy süllyedő alapvonalakat eredményezhet a gradiens elúció során. Az elválasztás elvégzése előtt mindig futtasson vak gradienst az esetleges adalékanyagok hatásának meghatározásához. Szükség esetén állítsa be a koncentrációt (lásd az eluens kiegyensúlyozása, 112. oldal). Vegye figyelembe, hogy a koncentráció megváltoztatása megváltoztathatja a mintakomponensek ionizációs fokát, és megváltoztathatja viselkedésüket az elválasztás során.

Szerves módosítók

A ismeretlen tulajdonságú minták esetében kezdje a leggyakrabban használt szerves módosítóval, az acetonitrillel.

A 210 nm alatti határértékkel az acetonitrilnek sokkal alacsonyabb a háttérabszorbanciája, mint más gyakori oldószereknek ezeken az alacsony hullámhosszakon, ami jobb alapvonal-stabilitást biztosít, amikor a szerves módosító tartalma változik az elválasztás során, és optimális detektálási érzékenységet biztosít.

Ionpárosító szerek hozzáadására lehet szükség (lásd fentebb).

2-propanolt használjon, ha erősebb eluálási tulajdonságokra van szükség, vagy a minta stabilitásának fenntartása érdekében. Vegye figyelembe, hogy a magasabb viszkozitás alacsonyabb oszlophatékonyságot és megnövekedett ellennyomást eredményez.

Ha az elúciós profil még mindig nem kielégítő, tekintse meg a 19. táblázatot, amely egyéb szerves módosítószereket tartalmaz. Vegye figyelembe, hogy a szerves módosító megváltoztatása befolyásolhatja a retenciós időt. A fehérjék elúciós sorrendjének változása valószínűleg a hidrofobicitásukat jelentősen megváltoztató denaturáció eredménye.

Típusos eluens protokollok fehérjék és peptidek elválasztásához

Ez a szakasz néhány gyakrabban használt eluens protokollt mutat be. A legtöbb protokoll legfeljebb 5% szerves módosítót tartalmaz az eluens A-ban és legfeljebb 80% szerves módosítót az eluens B-ben. Vegye figyelembe, hogy a 80% feletti koncentrációk befolyásolhatják a PEEK csöveket, amelyek gyakran vannak jelen a nagy teljesítményű kromatográfiás rendszerekben.

Szilika alapú közegek

Az A és B eluenseknek legalább 0,1% erős savat kell tartalmazniuk, hogy ionpárosítóként működjenek, alacsony pH-t tartsanak fenn, és minimalizálják a kevert módú visszatartást. A B eluensnek lényegesen nagyobb mennyiségű szerves módosítót kell tartalmaznia. Például:

Eluens A: 0,1% TFA vízben, 5% acetonitril

Eluens B: 0.1% TFA acetonitrilben (maximum 80%)

Polimer alapú közegek

Mivel a polimer alapú közegek szélesebb pH-tartományban használhatók, és nem kell aggódni a vegyes módú visszatartás miatt, valamint a szilanolcsoportok ionos kölcsönhatásait sem kell elnyomni, az eluens protokollok szélesebb skálája használható.

Az ismeretlen tulajdonságú vagy ismert savas körülményeket igénylő minták esetében

Eluens A: 0,065% TFA 2%-os acetonitrilben

Eluens B: 0.050% TFA 80%-os acetonitrilben

A bázikus körülményeket igénylő mintákhoz

Eluens A: 0.125%-os ammóniumoldat pH 10 2%-os acetonitrilben

Elúszó B: 80%-os acetonitril az A eluensben

Más rendszerek

Elúszó A: pH 2.1 0,1% hangyasav, 2% acetonitril

pH 2,0 0,1% ecetsav, 2% acetonitril

pH 2,0 0,1% TFA, 2% acetonitril

pH 4.5 10 mM nátrium-acetát, 2% acetonitril

pH 7,0 10 mM kálium-foszfát, 2% acetonitril

pH 9.0 10 mM Tris-HCl, 2% acetonitril pufferben

pH 12 10 mM NaOH, 2% acetonitril pufferben

Eluens B: 70% acetonitril az eluens A-ban

Bár a legtöbb eluens erős savakat és szerves oldószereket tartalmaz, amelyek kevés pufferkapacitást adnak, megfelelő pufferkapacitást kell fenntartani, ha a fiziológiai körülményekhez közelebbi körülmények között dolgozunk.

Előkészítés

1. Szűrje a szilárd anyagokat tartalmazó eluenseket 0,22 μm-es szűrővel. Ez megakadályozza, hogy a részecskék eltömítsék az oszlopot.
2. A szerves oldószer és a vizes oldatok térfogatát külön-külön mérjük meg, majd keverjük össze (ez kiküszöböli a szerves és vizes fázisok közvetlen keverésekor fellépő térfogatváltozásokat).
3. Az oldatokat szonikációs fürdőben (<15 perc), vákuumban mágneses keverés mellett (<5 perc) vagy héliummal történő tisztítással (<5 perc) oldjuk ki. Ez megakadályozza a buborékképződést az elúció során. Ügyeljen arra, hogy a gázmentesítési időt a lehető legalacsonyabban tartsa, hogy megakadályozza a szerves oldószer elpárolgását.
4. Adjon hozzá illékony ionpárosító szereket.

Frissen készített eluenseket használjon.

A kromatográfiás rendszer detektora után mindig használjon (a megfelelő nyomástartományhoz kompatibilis) áramláskorlátozót, hogy megakadályozza a levegő felhalmozódását a detektorban.

Ha az eluenseket tárolni kell, a tartályokat le kell zárni a párolgás okozta összetételváltozás elkerülése érdekében, és lehetőleg 4°C-on kell tartani. A vizes oldatokat semleges pH-nál 2-3 napnál tovább ne tárolja a mikrobák elszaporodásának veszélye miatt. A buborékképződés kockázatának csökkentése érdekében hagyja, hogy a hideg oldatok elérjék az üzemi hőmérsékletet, és használat előtt gázmentesítse őket.

Az RPC-ben használt erős savak és szerves oldószerek használatakor és ártalmatlanításakor tartsa be az egészségügyi és biztonsági előírásokat.