Liberase™ TM kutatási minőségű protokoll és hibaelhárítás

Termékszám:  LIBTM-RO

A megfelelő Liberase Research Grade enzimkeverék kiválasztása

A jelenlegi szövetdiszszociációs protokollja és az, hogy mennyire volt sikeres a hagyományos kollagenáz jó útmutatók a megfelelő Liberase enzimkeverék kiválasztásához. Válassza ki az Ön szövetdiszszociációs alkalmazásához leginkább hasonló Liberase Enzimkeveréket, vagy egy adott gyártó és kollagenáz típus alapján. Kérjük, olvassa el a "Liberase Research Grade Enzyme Blends Technical Tip - April 2010" című dokumentumot, vagy látogasson el a Roche Special Interest Site Tissue Dissociation (Szövetdiszszociáció) oldalára. A folyamatosan frissített táblázat a szövetdiszszociációs alkalmazások széles skáláját, valamint az ajánlott Liberase enzimkeverékeket és azok kiindulási koncentrációit tartalmazza. A táblázatban az egyes alkalmazásokhoz teljes szövegű protokollok vagy hivatkozások linkjei is megtalálhatók.

Liberase Research Grade: A Liberase Research Grade enzimkeverékeket használó protokollokért kérjük, látogasson el a Roche Special Interest Site Tissue Dissociation (Szövetdissociáció) oldalára. Az alábbi munkafolyamatokat rutinszerűen és sikeresen alkalmazzák a Roche K+F részlegeiben a következők izolálására:

• Hepatociták patkánymájból
• Pankreatikus szigetek patkány és egér hasnyálmirigyből
• Adipociták patkány epididymális zsírpárnákból
• Endotélsejtek emberi köldökvénából
• Endotélsejtek sertés és szarvasmarha aortából
• Kardiomyociták patkányszívből

Kérjük, vegye figyelembe, hogy a fenti eljárásokban megadott, az egyes enzimekhez tartozó munkakoncentrációk általános iránymutatások, amelyeket az egyéni igényekhez kell igazítani.Az egyes protokollok végén a hivatkozások hozzáférést biztosítanak a vonatkozó irodalomhoz.

Patkány hepatociták izolálása

Patkány hepatociták izolálásához a kollagenáz H ajánlott. Az intakt sejtek magas (akár 95%-os) hozamának eléréséhez a máj kollagenázzal történő perfúziója a megfelelő módszer^1-3. A perfúzió két lépésben történik a májkapuvénán keresztül, és kezdetben (első lépés) kalcium-eltávolító oldatot (Ca²⁺-mentes és/vagy EGTA-t tartalmazó), majd kollagenáz-tartalmú közeget (második lépés) tartalmaz. Mivel a kollagenáznak Ca²⁺-ra van szüksége, a második lépésben jelen kell lennie.

Készülékek és perfúziós készülék

A berendezésekre és a perfúziós készülékre vonatkozó részletes információkat a 2. hivatkozás tartalmazza.

Solutions

Perfúziós közeg (20 x; törzsoldat): NaCI, 138,0 g/l; KCI, 8,9 g/l; Na₂HP04, 11,4 g/l; NaH₂P04, 5.4 g/l; glükóz, 180,0 g/l; MgS0₄ x 7 H₂0, 6,0 g/l; steril. Perfúziós közeg (1 x munkaoldat; 1 I májanként): 50 ml perfúziós közeg (20 x); 22,5 ml steril NaHCO₃, 7,5%; 2 ml steril fenolvörös, 0,5%; töltsük fel 1000 ml-re steril redisztillált vízzel; állítsuk be a pH-t 7,4-re (1 N HCI-vel vagy 1 N NaOH-val). Ez a táptalaj ajánlott a máj perfúziójához és a sejtek mosásához. Az első perfúziós lépéshez 0,08 g/l (0,2 mmol/l, steril) EGTA adható a perfúziós közeghez (1 x) (lásd 2., 4. hivatkozás).A második perfúziós lépéshez készítsünk kollagenáz H oldatot a perfúziós közeghez (1 x). Ehhez 100 mg kollagenáz H-t oldunk fel 4 ml perfúziós közegben (1 x) (végső koncentráció 25 mg/ml) és szűrjük (0,2 μm-es szűrő). A kollagenáz aktiválásához 2,5 ml steril CaCI₂ oldatot, 200 mmol/l, kell hozzáadni 100 ml kollagenáz perfúziós közeghez.

Kultúrközeg

DMEM (1 x.1 g/l glükóz), amely MEM vitaminokat 1 x; MEM aminosavakat 1 x; nem esszenciális aminosavakat 1 x; glutamin, 2 mmol/l; laktát (pH 7,4), 1 %; penicillin/sztreptomicin, 1 %. Közvetlenül a sejtek beültetése előtt 5%-os magzati borjúszérumot (FCS) adjunk hozzá. A szubkultúrához adjunk a táptalajhoz 10^-4 mmol/l dexametazon és 2 x 10^-5 mmol/l inzulint. Szérummentes szubkultúra esetén az FCS-t 1 mg/l BSA-val kell helyettesíteni. Ezek a táptalaj-készítmények az első táptalajcsere után (90 perccel a tenyésztés után) használhatók.

Kollagén bevonó oldat

Olvasson fel 20 mg kollagént, pl. kollagént (I. típusú) vagy kollagént (patkányfarok) 10 ml steril, 0,1 N ecetsavban (végső koncentráció 2 mg/ml) vagy használjon steril kollagénoldatot, pl. kollagén S., Nátrium-pentobarbitál, pl. Nembutal^®, nátrium-heparin, pl., Liquemin^® 25000^®

Eljárás

Anesztezi a hím Spraque-Dawley patkányokat (testtömeg kb. 200 g) 50 μg Nembutal^® /g élőtömeggel (i.p.) és nyissuk fel a hasüregüket. A májat és a beleket kb. 0,5 ml liqueminnel permetezze be a koaguláció elkerülése érdekében. Fedje fel a májat, és injektáljon egy kanült a kapuvénába. Kezdjük meg a perfúziót (első lépés) Ca²⁺-mentes perfúziós közeggel, 50 ml H₂O nyomással. Az első 50 ml-t dobja el az eritrociták és a plazmafehérjék eltávolítása érdekében. Vegyük ki a májat, és helyezzük át egy perfúziós készülékbe, amely a perfuzátum hőmérsékletét +37 °C-on tartja, miközben folyamatosan oxigénnel táplálja. Perfundáljuk a májat (a véna cavalénán keresztül visszaáramoltatva) 100 ml (1x) karbogénnel (95% O₂, 5% CO₂) oxigénezett perfúziós közeggel 40 ml/perc áramlási sebességgel 5 percig. Adjunk steril kollagenázoldatot (4 ml 25 mg/ml oldatot) a perfúziós közeghez (végső koncentráció kb. 1 mg/ml), és folytassuk a perfúziót 10-30 percig (második lépés). A perfúziót akkor fejezzük be, amikor a máj puha állagot mutat (ujjnyomással ellenőrizve).

A perfúziót követően helyezzük a májat egy steril 50 mm-es Petri-csészébe, amely kb. 20 ml perfúziós tápfolyadékot tartalmaz (1 x), két steril csipesszel törjük fel a májkapszulát, és a szervet óvatosan rázva disszociáljuk a májsejteket. Távolítsa el a nem disszociált szövetdarabokat, és szűrje a sejtszuszpenziót 74 μm-es szűrőn vagy 4 lap steril gézen keresztül. A szűrletet gyűjtsük fel egy steril főzőpohárba, és töltsük fel 200 ml-re perfúziós tápfolyadékkal (1 x; karbogénnel oxigénezett). A sejtszuszpenziót 50 ml-es adagokban 60 másodpercig forgassuk (50 x g, szobahőmérsékleten), és szuszpendáljuk újra a sejteket perfúziós tápfolyadékban (1 x; karbogénnel oxigénezett), a térfogatot 50%-kal csökkentve. Ismételjük meg ezt a mosási eljárást kétszer, minden alkalommal 50%-kal csökkentve a térfogatot. Reszuszpendáljuk a sejteket FCS-t tartalmazó táptalajban, és 3 x 10⁵ sejt/ml sejteket ültessünk kollagénnel bevont (2,5 μL/cm² 2 mg/ml kollagénbevonatú oldatból) tenyésztőedényekbe. Inkubáljuk +37 °C-on, 5% CO₂ mellett. Távolítsa el a táptalajt és a nem rögzített sejteket 90 perccel a kiültetés után. További sejttenyésztéshez (szubkultúrához) szérummentes táptalaj használható.

Liberase Research Grade: Bőrszövet

A németországi stuttgarti Fraunhofer Intézet külső Roche partnerei szisztematikusan vizsgálták a Liberease Research Grade enzimkeverékeket keratinociták és fibroblasztok izolálására emberi fitymaszövet epidermiszéből. További információkért kérjük, látogasson el a Roche Special Interest Site Tissue Dissociation oldalára.

Liberase Research Grade ajánlott a patkány szívizomsejtekhez

Az ajánlott Liberase DH Research Grade körülbelül 200 μg/ml. A protokollt a Special Interest Site Tissue Dissociation (Szövetdissociáció) című weboldalunkon találja. Ezen kívül számos más protokollt is talál a Liberase adatbázisban.

Liberase Research Grade: Dissociation of Fatty Tissue

A második generációs Liberase Research Grade termékekkel történő sejtek zsírszövetből történő izolálására vonatkozó alkalmazási adatok nem állnak rendelkezésre. A Roche Special Interest Site Tissue Dissociation (Szövetek disszociációja) oldalon azonban található egy protokoll az első generációs termék, a Liberase Blendzyme 3 használatával történő zsírsejtek izolálására.

A "Átmenet a korábbi Liberase enzimkeverékekről" szakasz segíthet a megfelelő új termék kiválasztásában, amely könnyen átalakítja a koncentrációt.

Liberase Research Grade: Paraffinba ágyazott szövetek

A sejtek izolálása paraffinba ágyazott szövetekből a Liberase enzimekkel nem került értékelésre.

Extracelluláris antigének kimutatása

A Roche Special Interest Site Tissue Dissociation (Szövetek disszociációja) oldalon elérhető egy protokoll a lépből származó dendritikus sejtekre vonatkozóan. E protokoll kidolgozásához mind az öt új Liberase Research Grade enzimkeveréket teszteltük. A legjobb eredményeket a Liberase TL és DL Research Grade enzimkeverékekkel kaptuk. Az olyan antigének, mint az MHCII, DC11c és CD8 kimutathatók voltak.

Megjegyzés: A fenti protokollokat az ügyfelek fejlesztették ki, és a Roche nem validálta azokat. A Roche nem vállal felelősséget a protokollok tartalmáért és sikeres végrehajtásáért. A Roche az ügyfelek által készített protokollokat a Roche honlapon iránymutatásként és kiindulási pontként, valamint a tudományos információk kutatóközösségen belüli cseréjét elősegítő szolgáltatásként bocsátja rendelkezésre.

Celldissociáció a rágcsálók újszülöttkori agyszövetéből közvetlenül a FACS-válogatás előtt

A Roche nem kínál protokollt újszülöttkori rágcsálók agyszövetének Liberase Research Grade Enzyme Blends használatával történő izolálására. Ehhez az alkalmazáshoz kiindulási pontként a Liberase DH és DL Research Grade lenne a legkíméletesebb termék, mivel az ezekben a Liberase enzimkeverékekben található semleges proteáz a Dispase^®. Részletesebb termékinformációkért kérjük, olvassa el a Roche Special Interest Site-on.

Sz sejtek izolálása tüdőtumorszövetből Liberase TM Research Grade használatával

A tüdőtumorszövetből történő sejtizolálás kísérleti részleteiért kérjük, olvassa el a Roche Applied Science Special Interest Site-on található publikációt. Kiindulási alapként 10 ml munkaoldatot használtunk 0,25 Wünsch egység/ml Liberase TM Research Grade-t grammonként tüdőszövetre.

Hibaelhárítás

Enzimösszetétel

Minden Liberase Research Grade enzimkeverék kollagenáz I és II és egy semleges proteáz keverékéből áll. A Liberase TL, TM és TH Research Grade kollagenáz I, II és a semleges proteáz termoliszint tartalmazza. A Liberase DL és DH Research Grade kollagenáz I, II és a semleges proteáz Dispase^®.

Látogasson el a Roche Special Interest Site Tissue Dissociation oldalára, hogy megtudja, hogyan különböznek ezek az enzimkeverékek agresszivitásukban, és hogy meghatározza az Ön alkalmazásához megfelelő Liberase Research Grade-et. Ha az Ön alkalmazása nem szerepel a jelenlegi adatbázisunkban, kérjük, lépjen tovább a következő szakaszra: "Liberase TM Research Grade." A Liberase Research Grade enzimkeverék kiválasztása az 1^st generációs Liberase Blendzymekkel és a hagyományos kollagenázokkal szerzett tapasztalatai alapján is történhet a Liberase enzimválasztási útmutatók segítségével.

Kollagenáz és Liberase Blendzymek: A hagyományos kollagenáz-készítményeket bakteriális (Clostridium histolyticum) tenyészetek felülúszójából izolálják. Ezek a készítmények heterogének, akár 30 különböző enzimet, sejttörmeléket, pigmenteket és endotoxint is tartalmazhatnak. Az endotoxinszint és a változékonyság a hagyományos kollagenáz legjelentősebb hátránya. A liberáz enzimek számos előnnyel rendelkeznek, amelyek jelentősen megkülönböztetik őket a hagyományos kollagenázoktól. Mivel minden egyes Liberase tisztított enzimkeveréket kifejezetten alkalmazásonként, válaszfelület-modellezéssel alakítottunk ki, optimális eredmények várhatók a következők tekintetében:

• Növeltebb sejthozam
• Növeltebb sejtéletképesség
• Nagyobb sejtfunkcionalitás

Minden Liberase tétel azonos enzimaktivitási specifikációkkal rendelkezik. Minden egyes tétel endotoxin-tesztelésen esik át, hogy biztosítsuk a következetesen alacsony szintet. Nincs szükség többé tételválasztásra vagy teljes tételfoglalásra. Minden egyes tétel garantáltan azonos teljesítményt nyújt bármely adott szövetdiszszociációs protokollban.

A részletesebb információkért kérjük, olvassa el a Special Interest Site Tissue Dissociation (Szövetdiszszociáció) webhelyet.

RNS-szennyezés

Az RNázmentesség nem minőségellenőrzési kritériuma a Liberase gyártási eljárásának. A szöveti disszociáció során a sejtek megbomlanak és RNázok szabadulnak fel. Emiatt az RNázmentes minőség nem nyújt további előnyt.

A Liberase Research Grade összetevői magasan tisztított készítmények. A HPLC kromatogramok azt mutatják, hogy a kollagenáz I és II és a semleges proteázon kívül nincs más fehérje.

Liberase Research Grade elemzési tanúsítványok

A Liberase Research Grade termékek 2. generációs elemzési tanúsítványai (CoA) feltüntetik a Col Ia, Col I és Col II mennyiségét, az endotoxinszintet és a liofilizátum megjelenését.

A Liberase első generációs keverékeket egy változékonyabb aktivitásvizsgálat alkalmazásával bocsátották ki. Az aktivitásértékeket a CoA-ban adták meg. Ezzel szemben a 2. generációs Liberase Research Grade termékeket a fehérjemennyiség (HPLC és fehérjetömeg) alapján bocsátják ki, és nagyobb a tételenkénti konzisztencia.

A semleges proteáz aktivitásvizsgálata is megváltozott a 2. generációs Liberase termékekben. A FITC kazein egységeket már nem mérik. A FITC-tesztet egy nem fluoreszcens aktivitásvizsgálat váltotta fel. A semleges proteáz mennyisége nem változott. Az új teszt segítségével meghatározott semleges proteáz aktivitás megfelel a korábban meghatározott FITC egységeknek.

Kollagenáz/Liberáz kutatási minőségű enzimkeverékek: Különböző típusokba való besorolás

A bakteriális kollagenáz, vagy pontosabban a klosztridiopeptidáz A egy olyan proteáz, amely a Pro-X-Gly-Pro szekvencia X-Gly kötésére specifikus, ahol az X leggyakrabban egy semleges aminosav. Ilyen szekvenciák nagy gyakorisággal fordulnak elő a kollagénben, és csak ritkán más fehérjékben. A tisztított klosztridiopeptidáz A nem hatékony a szövetek disszociációjában a kollagén polipeptidek nem teljes hidrolízise és az extracelluláris mátrixban található nem kollagén fehérjék és egyéb makromolekulák magas koncentrációjával szembeni korlátozott aktivitása miatt. A szövetek disszociációjára leggyakrabban használt kollagenáz a baktériumokból származó nyers készítmény, amely számos más proteáz és lipáz mellett klosztridiopeptidáz A-t is tartalmaz.

A nyers kollagenázok különböző enzimaktivitások keverékei, így számos kereskedelmi forgalomban kapható kollagenáz alapját képezik. Ezek a kollagenáztípusok a kollagenáz és más proteázok, köztük a klosztripain, egy tripszinszerű aktivitással rendelkező és egy semleges proteáz relatív mennyisége szerint változnak. Például a Roche′s kollagenáz A, B és D különböző arányban tartalmazza a különböző proteolitikus aktivitásokat, míg a kollagenáz H és P a patkányból származó hepatociták (H) és hasnyálmirigy-szigetsejtek (P) izolálásához tesztelt funkciót. Ez megkönnyíti az adott szövet disszociációjához legjobban alkalmas készítmény kiválasztását.

A Roche kollagenázt Wünsch egységekben mérik (1 pmol termék képződik percenként +25 °C-on, Wünsch szubsztráttal). Gyakran a kollagenáz aktivitást Mandl-egységben adják meg (1 μmol leucin felszabadulása a kollagénből 5 óra alatt +37 °C-on). A mai napig nincs elfogadott átváltási tényező erre a két aktivitási egységre, mivel az egység részben a kollagenázkészítményben lévő szennyező proteázok koncentrációjától függ, ami egy meghatározhatatlan változó. Az egység meghatározásában és az enzimaktivitás összetételében mutatkozó különbségek miatt bonyolult a különböző beszállítóktól származó kollagenázok pontos összehasonlítása vagy átváltása.Részletesebb információkért kérjük, olvassa el a "Liberase Research Grade Enzyme Blends Technical Tip - April 2010" című dokumentumot.

Reconstitution:

1. Növelje a rekonstitúciós puffer térfogatát 2-szeresére.
2. Vortexeljen röviden.
   

Optimalizálja a szövetdiszszociációs eljárást:

Fontos pontok az optimalizáláshoz:

• A liberáz kutatási minőségű tisztított enzimkeverékek csak kollagenázt és semleges proteázt tartalmaznak.
• A kollagenáz enzimek az intercelluláris mátrixot emésztik meg.
• A semleges proteázok szinergikusan hatnak a kollagenázzal.
• Elégséges idő és koncentráció mellett a semleges proteázok károsítják a sejtfelszíni fehérjéket.
• A disszociáció ideje, az enzimarányok és az enzimkoncentráció mind befolyásolják a szövet-diszszociáció eredményét.
• A Liberase Research Grade tisztított enzimkeverékeket módosító tényezők, például szérum, BSA vagy proteáz inhibitorok nélkül használja.

Figyeljen arra, hogy a Liberase enzimmel izolált sejtjeinek hozama, életképessége vagy funkcionalitása nem optimális. Keresse meg a valószínű okot, majd cselekedjen az ajánlás szerint. A Liberase Research Grade panelen belül növekvő semleges proteáz specifikus aktivitással kapcsolatos információkért olvassa el a "Biológiai aktivitás" című fejezetben leírt enzimkeverék agresszivitását.

megfigyelés 1	megfigyelés 2	lehetséges ok		megfigyelés 1		Ajánlás
alacsony sejtéletképesség	A disszociáció nagyon gyors	Túl magas az enzimkoncentráció	Visszacsökkentjük az enzimkoncentrációt 50%-kal.
		Az enzimkeverék agresszivitása túl magas		Válasszon egy Liberase Research Grade tisztított enzimkeveréket, amely kisebb mennyiségű semleges proteázt tartalmaz.
	A disszociáció nagyon lassú	Túl alacsony enzimkoncentráció		Növelje az enzimkoncentrációt 50%-kal.
		Az enzimkeverék agresszivitása túl alacsony		Válasszon Liberase kutatási minőségű tisztított enzimkeveréket, amely nagyobb mennyiségű semleges proteázt tartalmaz.
Károsodott sejtfunkció		Cellák életképessége >80%, a sejthozam elfogadható	Visszacsökkentse az enzimkoncentrációt 25%-kal.
		Az enzimkeverék agresszivitása túl magas		Válasszon egy Liberase Research Grade tisztított enzimkeveréket, amely kisebb mennyiségű semleges proteázt tartalmaz.
alacsony sejthozam	Cellák életképessége >80%	Túl alacsony enzimkoncentráció	Növelje az enzimkoncentrációt 25-50%-kal.
		Az enzimkeverék agresszivitása túl alacsony		Válasszon nagyobb mennyiségű semleges proteázt tartalmazó Liberase Research Grade tisztított enzimkeveréket.
	Cellák életképessége <80%	Túl magas enzimkoncentráció		Visszacsökkentse az enzimkoncentrációt 50%-kal.
		Az enzimkeverék agresszivitása túl magas		Válasszon egy Liberase Research Grade tisztított enzimkeveréket, amely kisebb mennyiségű semleges proteázt tartalmaz.
		A mechanikai (nyíró)erő túlzott		Visszaszorítsa a nyíróerőt a disszociáció minden aspektusában. Kíméletesen kezelje a szövetet.
A felszabadult sejtek zselatinos, zsinórszerű formában csomósodnak		A sejthozam és életképesség elfogadható	A sejtlízist követő DNS-felszabadulás okoz csomósodást		Egyes szövetekben gyakoribb. Ha a sejtek életképessége elfogadható, adjon DNázt a disszociációs keverékhez.
	A sejtek hozama vagy életképessége csökken	A mechanikai (nyíró)erő túlzott		A nyíróerő csökkentése a disszociáció minden aspektusában. Kíméletesen kezelje a szöveteket.

Hivatkozások

1. Berry NM and Friend SD, 1969, Isolated rat hepatocytes, J. Cell. Biol., 43, 506 - 520.

2. Seglen, P.O, 1976, Preparation of isolated rxat liver cells, Methods Cell Biol., 13, 29-83.

3. Schlepper-Schäfer J, Kolb-Bachofen V, Kolb H. 1980. Analysis of lectin-dependent recognition of desialylated erythrocytes by Kupffer cells. 186(3):827-831. https://doi.org/10.1042/bj1860827

4. Laishes BA, Williams GM. 1976. Conditions affecting primary cell cultures of functional adult rat hepatocytes. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant. 12(7):521-532. https://doi.org/10.1007/bf02796495

A LIBERASE a Roche védjegye
Minden más terméknév és védjegy a megfelelő tulajdonosok tulajdonát képezi.