RT-qPCR – Quantitative PCR mit reverser Transkription

In der RT-qPCR oder quantitativen PCR mit reverser Transkription werden die Effekte der reversen Transkription und der quantitativen PCR oder Echtzeit-PCR für die Amplifikation und den Nachweis spezifischer Ziele kombiniert. Die RT-qPCR wird in vielen Anwendungen eingesetzt, darunter die Quantifizierung der Genexpressionsniveaus, die Validierung der RNA-Interferenz (RNAi) und der Nachweis von Krankheitserregern wie Viren. Übliche Ansätze zur Erzeugung eines Fluoreszenzsignals, das zur Messung der DNA-Menge in dieser Technik verwendet wird, sind entweder Hydrolysesonden wie TaqMan^® Sonden oder ein Bindungsfarbstoff für doppelsträngige DNA wie der SYBR^® Green-Farbstoff.

Was ist RT-qPCR?

Bei der quantitativen PCR mit reverser Transkription (RT-qPCR) geht es um den Nachweis und die Quantifizierung von RNA. Das Verfahren erfolgt durch reverse Transkription der Gesamt-RNA oder mRNA in komplementäre DNA (cDNA) durch das Enzym reverse Transkriptase, gefolgt von der Amplifikation und dem Nachweis spezifischer Ziele dieser cDNA durch eine Technik, die als quantitative PCR (qPCR) oder Echtzeit-PCR bezeichnet wird. Bei jedem Zyklus dieser PCR wird die DNA-Menge in Echtzeit mit einer Vielzahl von Fluoreszenzchemikalien gemessen. Die gebräuchlichsten Ansätze zur Erzeugung eines Fluoreszenzsignals sind die Verwendung von Hydrolysesonden wie TaqMan^® Sonden oder eines Bindungsfarbstoff für doppelsträngige DNA, wie SYBR^® Green.

Die Auswahl der Fluoreszenzchemie hängt von Faktoren wie der Anwendung, den Kosten und der Frage ab, ob es sich um einen Singleplex- oder Multiplex-Assay handelt. DNA-bindende Farbstoffe werden für Singleplex-Assays mit geringem Durchsatz bevorzugt, da sie einfacher zu planen sind, weniger Zeit für die Einrichtung benötigt wird und sie kostengünstiger sind. Fluoreszenzsonden werden üblicherweise in Multiplex-Assays mit hohem Durchsatz eingesetzt, die eine höhere Spezifität erfordern.

Weitere Informationen zur qPCR finden Sie in unserem Technischen Leitfaden zur quantitativen PCR

Anwendungen der RT-qPCR

Die RT-qPCR kann in einer Vielzahl Anwendungen eingesetzt werden. Die RT-qPCR-Technik wird verwendet, um:

• Das Niveau der Genexpression zu quantifizieren
• RNAi zu validieren, um den Funktionsverlust selektiver Gene zu untersuchen
• Pathogene wie Viren zur Diagnose von Infektionskrankheiten nachzuweisen
• Gentechnisch veränderte Organismen (GVO) nachzuweisen

Einstufige RT-qPCR vs. zweistufige RT-qPCR

RT-qPCR wird entweder in einem einstufigen oder einem zweistufigen Assay durchgeführt. Bei der Auswahl der richtigen RT-qPCR-Methode müssen verschiedene Faktoren wie Kosten, Anwendung und Assay-Typ berücksichtigt werden.

Abbildung 1. Diagramm zum Vergleich zwischen einstufigem und zweistufigem RT-qPCR-Workflow.

Einstufige RT-qPCR

Bei der einstufigen RT-qPCR werden die reverse Transkription oder die cDNA-Synthese und die qPCR in einem einzelnen Röhrchen durchgeführt, wobei sequenzspezifische Primer für die Amplifikation eines bestimmten Ziels eingesetzt werden. Gentechnisch veränderte reverse Transkriptasen werden häufig in einstufigen Assays eingesetzt, da sie höheren Temperaturen standhalten, die für die Hybridisierung sequenzspezifischer Primer erforderlich sind. Ein einstufiger Assay wird bevorzugt, wenn eine wiederholte Quantifizierung desselben Gens durchgeführt wird, insbesondere bei Hochdurchsatz- und Diagnoseanwendungen. Eine weitere Überlegung bei der Auswahl einstufiger Assays ist die Qualität und Knappheit der RNA. Da die während der Reaktion synthetisierte cDNA nicht separat als Aliquot gespeichert werden kann, sind möglicherweise mehrere Proben der ursprünglichen RNA erforderlich, um den Assay zu wiederholen.

Zweistufige RT-qPCR

Bei der zweistufigen RT-qPCR werden die reverse Transkription und die qPCR-Reaktionen in getrennten Röhrchen mit separaten Puffern und Reagenzien durchgeführt. In zweistufigen Assays können zufällige Hexamere, Oligo-dT-Primer und/oder genspezifische Primer verwendet werden. Getrennte Puffer und Reagenzien ermöglichen mehr Flexibilität bei der Auswahl der Enzyme für die reverse Transkriptase und der PCR-Reagenzien und bieten mehr Möglichkeiten zur Optimierung und Verbesserung der Amplifikationseffizienz schwieriger Templates. Die stabilere cDNA, die im ersten Schritt synthetisiert wird, kann weiter konzentriert und/oder aufgereinigt werden, um sie entweder für eine spätere Verwendung aufzubewahren oder für die Quantifizierung mehrerer Gene aus der gleichen Probe einzusetzen.

Tabelle 1.Hauptmerkmale und Primer, die in einstufigen und zweistufigen RT-qPCR-Assays verwendet werden.

Assay-Typ	Verwendete Primer	Hauptmerkmale
Einstufige RT-qPCR	Sequenzspezifische Primer	Reduzierte Versuchsvariation Einfache Handhabung mit geringem Kontaminationsrisiko Schnelleres Protokoll mit weniger Schritten Einfache Automatisierung Verbesserte Spezifität Ideal für Hochdurchsatzanwendungen
Zweistufige RT-qPCR	Oligo- (dT) Primer, zufällige Hexamere und/oder sequenzspezifische Primer	Flexibilität zur separaten Optimierung von RT- und PCR-Reaktionen Ermöglicht mehrere PCR aus einer einzelnen RNA/RT-Probe ohne Multiplexing Größere Auswahl an RT-Primern Stabile cDNA kann für die spätere Verwendung gelagert werden

Weitere Informationen zur PCR-Assay-Optimierung finden Sie unter Assay-Optimierung und -Validierung.

Produkte für Hochdurchsatzanwendungen in der einstufigen RT-qPCR

Durch unsere einstufigen RT-qPCR-Produkte wird die Wirkung der reversen Transkriptase mit dem Hot-Start-Taq-Antikörper in praktischen ReadyMixTM-PCR-Reaktionsmischungen für sondenbasierte SYBR^® Green-basierte Anwendungen kombiniert. Unabhängig von schwierigen Sekundärstrukturen oder schwieriger Nachweischemie sind unsere ReadyMixTM-PCR-Reaktionsmischungen speziell formuliert, um in weniger Schritten hervorragende Ergebnisse zu erzielen.

Unsere Produkte fügen sich problemlos in Ihren PCR-Workflow ein. Und mit einer Vielzahl zuverlässiger Produkte für einstufige RT-qPCR-Versuche treffen Sie immer die richtige Wahl. Entdecken Sie die KiCqStart^® Produkte und finden Sie einen ReadyMix™ Mastermix, der für Ihr Gerät optimiert ist. Oder entdecken Sie unsere JumpStart™ Optionen für Kits, die für Ihre Versuchsanforderungen optimiert werden können. Für die einstufige RNA-Quantifizierung mit hohem Durchsatz und schnellem Zyklus unter Verwendung sequenzspezifischer fluorogener Sonden wählen Sie das KAPA PROBE FAST Universal-Kit. Entscheiden Sie sich vertrauensvoll für eines unserer RT-qPCR-Produkte, ohne Kompromisse bei der Qualität einzugehen.

KiCqStart^® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ – Kompatibel mit allen gängigen qPCR-Geräten

Unsere KiCqStart^® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ Reagenzien verfügen über einen strengen Hot-Start-Mechanismus für höhere Spezifität und sind so formuliert, dass sie gegenüber PCR-Inhibitoren in den Proben äußerst tolerant sind. Diese hochsensiblen, gebrauchsfertigen Mastermischungen sind einfach zu handhaben und enthalten alle erforderlichen Basiskomponenten für qPCR oder RT-qPCR. Fügen Sie einfach Ihre Primer, Sonde und Wasser hinzu, um den Assay-Cocktail zu vervollständigen. Dieses Produkt ist ideal für schnelle oder konventionelle qPCR

Art.-Nr.	Produktname	Merkmale
KCQS07	KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™	Für Bio-Rad®, Cepheid®, Eppendorf®, Illumina®, Corbett® und Roche® Geräte
KCQS08	KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™, Low ROX™	Für Applied Biosystems® (ABI) und Stratagene® Geräte
KCQS09	KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™, ROX	Für Applied Biosystems® (ABI) Geräte

Erfahren Sie mehr über die Gerätekompatibilität mit diesen Produkten in unserer vollständigen Gerätekompatibilitätsübersicht oder entdecken Sie unsere kundenspezifischen qPCR-Sonden.

JumpStart™ Taq ReadyMix™ – Optimierbar für alle wichtigen qPCR-Geräte

Unsere JumpStart™ Taq ReadyMix™ Produkte für die RT-qPCR kombinieren die Vorteile der Moloney Maus-Leukämievirus Reverse Transkriptase (M-MLV RT) und unserer JumpStart™ Antikörper-inaktivierten Taq-Polymerase. Die robuste M-MLV RT ist in der Lage, auch bei erhöhten Temperaturen durch schwierige Sekundärstrukturen zu transkribieren, während unsere JumpStart™ Taq-Polymerase eine höhere Spezifität und Sensitivität als Standard-Taq-Polymerase bietet. Diese Produkte sind sowohl mit Röhrchen- und Plattengeräten als auch mit Kapillargeräten kompatibel.

Sparen Sie 20 % beim Kauf unseres RT-qPCR ReadyMix™ (QR0200), indem Sie den Code SGX an der Kasse verwenden. Gültig bis 31. Januar 2021.

Art.-Nr.	Produktname	Merkmale
QR0100	SYBR® Green RT-qPCR	Hohe Spezifität, geringes Kontaminationsrisiko, einfache Reproduzierbarkeit
QR0200	RT-qPCR ReadyMix™ für sondengestützte Anwendungen	Hohe Spezifität, geringes Kontaminationsrisiko, einfache Reproduzierbarkeit

KAPA PROBE FAST  – Kompatibel mit allen auf fluorogenen Sonden basierenden Technologien

Das KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Mastermix Universal-Kit ist eine empfindliche und praktische Lösung für die Echtzeit-PCR unter Verwendung von RNA als Template. Das Kit ist für die Quantifizierung von RNA in einem Schritt mit hohem Durchsatz und schnellem Zyklus unter Verwendung sequenzspezifischer fluorogener Sonden konzipiert. Es ist mit allen auf fluorogenen Sonden basierenden Technologien kompatibel, darunter Hybridisierungssonden (z. B. Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-Sonden), Hydrolyse-Sonden (z. B. TaqMan^® Sonden) und Verdrängungssonden (z. B. Molecular Beacons).

Bei diesem Kit handelt es sich um einen gebrauchsfertigen Cocktail, der alle Komponenten außer Primer, Sonde(n) und Template für die Schnellzyklus-, sondenbasierte Echtzeit-PCR enthält. Das Kit enthält KAPA PROBE FAST qPCR Mastermix, ROX High und ROX Low Referenzfarbstoffe, KAPA RT-Mix und dUTP.

Art.-Nr.	Produktname	Merkmale
KK4752	KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Mastermix (2X) Universal-Kit	Einstufige RNA-Quantifizierung mit hohem Durchsatz und Schnellzyklus unter Verwendung sequenzspezifischer fluorogener Sonden

ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit  – Kompatibel mit allen gängigen qPCR-Geräten

Die im Kit enthaltene ABScript II Reverse Transkriptase ermöglicht eine zuverlässige reverse Transkription von RNA. Nach der reversen Transkription wird die Hot-Start-Version der Taq-Polymerase bei 95 °C aktiviert und gleichzeitig die ABScript II Reverse Transkriptase inaktiviert. In der sequenziellen PCR-Reaktion spaltet die 5′-3′-Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase die hybridisierte Sonde, trennt den Reporter vom Quencher und setzt ein Fluoreszenzsignal frei.

Das ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit ist ein gebrauchsfertiges Kit für reverse Transkription und anschließende sondenbasierte qPCR in einem einzelnen Röhrchen. Das flexible Format dieses Kits umfasst zwei separate 50X Konzentrationen des ROX-Farbstoffs (passive Referenz), die je nach Bedarf des jeweiligen qPCR-Geräts hinzugefügt werden können.

Art.-Nr.	Produktname	Merkmale
RK20407	ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit	Analysiert RNA-Proben mit niedriger Eingabe, geringes Kontaminationsrisiko

Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.

Zweistufige RT-qPCR-Produkte für höhere Flexibilität

Wir bieten alle Reagenzien für die reverse Transkription und die anschließende PCR-Analyse der synthetisierten cDNA in separaten Röhrchen an, damit Ihre Versuche flexibler gestaltet werden können. Integrieren Sie unsere zweistufigen RT-qPCR-Produkte vertrauensvoll in Ihren PCR-Workflow, ohne Kompromisse in Bezug auf die Flexibilität einzugehen. Mit den verschiedenen Optionen, die für unsere zuverlässigen PCR-Produkte zur Verfügung stehen, treffen Sie die richtige Wahl.

cDNA-Synthese-Kits und -Mischungen

Um Ihren Anforderungen an die reverse Transkription gerecht zu werden, können Sie aus verschiedenen Enzymtypen und Verpackungsoptionen wählen. Alle diese Produkte enthalten die für die Erststrangsynthese erforderlichen Reagenzien und sind als Kits mit separaten Reagenzien für die Optimierung oder als Komplettmischungen für die schnelle und komfortable Erststrangsynthese erhältlich.

Art.-Nr.	Produktname	Merkmale
STR1	Avian-Kit für die erweiterte Erststrangsynthese	Hochaufgereinigte eAMV-RT – Transkribieren schwieriger Sekundärstrukturen bei hoher Temperatur Nachweis von mRNA mit niedriger Abundanz
11483188001	Erststrang cDNA-Synthesekit für die RT-PCR	Enthält AMV RT für höhere Thermostabilität im Vergleich zu M-MuLV RT Enthält RNase-Inhibitor und dNTP-Mix für PCR
RDRT	ReadyScript™ cDNA-Synthese-Mix	Empfindliche und einfach handzuhabende Lösung für die zweistufige RT-PCR ReadyScript™ Enzym ist ein mit RNase H (+) modifiziertes M-MuLV RT
11117831001	cDNA-Synthese-Kit	Optimiertes Ein-Röhrchen-Verfahren für die Synthese doppelsträngiger cDNA bis zu 3 kb aus Gesamt-RNA oder mRNA
THIFICDNARO	Transcriptor High Fidelity cDNA-Synthesekit	Entwickelt für die reverse Transkription von RNA mit höherer Genauigkeit als andere reverse Transkriptasen Optimiert für zweistufige RT-PCR
5893151001	Transcriptor Universal-cDNA-Master	Bequeme und schnelle Lösung für die cDNA-Synthese und Echtzeit-PCR-Analyse Unabhängig davon, welches PCR-Gerät Sie verwenden, schöpft dieser Mastermix, der in zwei Fläschchen geliefert wird, das volle Potenzial Ihrer qRT-PCR-Assays aus

RT Enzyme – Reverse Transkriptasen

Wählen Sie aus unserer Sammlung von RT-Enzymen ein Enzym aus, das der Komplexität Ihres RNA-Transkripts entspricht. Unsere Produkte umfassen Standard-Vogelmyeloblastosevirus (AMV) und Moloney-Maus-Leukämievirus (M-MLV) reverse Transkriptasen sowie erweiterte Versionen der vorgenannten Produkte für eine höhere Empfindlichkeit.

Art.-Nr.	Produktname	Merkmale
A4464	Verbesserte Avian-Reverse-Transkriptase	Höhere Empfindlichkeit für mRNA mit niedriger Abundanz Bestes Enzym für die Transkription durch schwierige Sekundärstrukturen
ERT-RO	Expand™ Reverse Transkriptase	Transkribiert cDNA-Fragmente bis zu 13,5 kb Es können cDNA oder einzelsträngige DNA verwendet werden
M1302	M-MLV Reverse Transkriptase	Einsatz von einzelsträngiger RNA, DNA oder RNA-DNA-Hybrid Erzeugung von cDNA-Erststrängen bis zu 7 kb
10109118001	Reverse-Transkriptase-AMV	Enthält 5X cDNA-Erststrangsynthese-Puffer
11062603001	Reverse Transkriptase M-MuLV	Fehlende Endonuklease-Aktivität und deutlich geringere RNase H-Aktivität als AMV RT
TRANSRTRO	Transcriptor Reverse Transkriptase	Erzielen hoher Empfindlichkeit mit der zweistufigen RT-PCR. Transcriptor Reverse Transkriptase wird in herkömmlichen Thermocyclern und Echtzeit-PCR-Geräten (z. B. LightCycler® Geräten) verwendet. Reverse Transkription schwieriger Templates. Das Enzym arbeitet gut bei erhöhten Temperaturen, wodurch die RNA-Sekundärstruktur (z. B. GC-reiche RNA-Templates) überwunden und optimale Reaktionsbedingungen möglich werden.

Weitere Informationen zur RT-qPCR-Fehlerbehebung finden Sie auf unserer Seite zur Fehlerbehebung in der RT-PCR / RT-qPCR.

qPCR-Kits

Diese ReadyMix^TM Produkte enthalten alle für die qPCR erforderlichen Komponenten. Fügen Sie einfach die fluoreszierende Nachweischemie, Primer und Template hinzu.

Sondenbasierte qPCR

Die sondenbasierte qPCR beruht auf dem sequenzspezifischen Nachweis eines gewünschten PCR-Produkts. Im Gegensatz zu SYBR^® Green-basierten qPCR-Methoden, in welchen die gesamte doppelsträngige DNA nachgewiesen wird, wird bei der sondenbasierten qPCR eine fluoreszenzmarkierte zielspezifische Sonde verwendet, was zu einer erhöhten Spezifität und Sensitivität führt. Darüber hinaus ist eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen erhältlich, sodass mehrere Primer zur gleichzeitigen Amplifikation vieler Sequenzen verwendet werden können.

Art.-Nr.	Produktname	Merkmale
D6442	JumpStart™ Taq ReadyMix™ für quantitative PCR mit hohem Durchsatz	Gebrauchsfertige 2x-Mischung für qPCR mit ROX Ideal für quantitative PCR-Methoden mit hohem Durchsatz mittels Fluoreszenzsondennachweis JumpStart™ Taq verhindert unspezifische Amplifikation und erhöht die Zielausbeute
D7440	JumpStart™ Taq ReadyMix™ für die quantitative PCR	Gebrauchsfertige 2x-Mischung für die Durchführung quantitativer PCR-Assays auf Basis von Fluoreszenzsonden
L6669	LuminoCt® qPCR ReadyMix™	Ideal für schnelle zweistufige qPCR-Protokolle mit hohem Durchsatz und Assay-Ergebnissen in nur 25 Minuten Für schnelle sondenbasierte quantitative PCR
FSTMPMMRO	FastStart TaqMan® Probe Master	Verwendung mit jedem Echtzeit-qPCR-Gerät außer LightCycler® Geräten Auswahl zwischen zwei Formulierungen – eine mit ROX-Referenzfarbstoff, eine ohne ROX Enthält dUTP zur Vermeidung von Kontaminationsverschleppungen
FSUPMMRO	FastStart Universal Probe Master (Rox)	Erreichen empfindlicher, spezifischer Ergebnisse in Assays mit den Universal ProbeLibrary-Sonden oder jeder anderen Hydrolysesonde. Amplifizieren von Fragmenten mit einer Länge bis zu 500 bp, einschließlich GC- oder AT-reicher Fragmente Enthält dUTP zur Vermeidung von Kontaminationsverschleppungen
PFUKB	KAPA PROBE FAST qPCR-Mastermix, Universal	Kompatibel mit allen auf fluorogenen Sonden basierenden Technologien, einschließlich Hybridisierungssonden (z. B. FRET), Hydrolysesonden (z. B. TaqMan® Sonden) und Verdrängungssonden (z. B. Molecular Beacons).

SYBR^® Green-basierte qPCR

SYBR^® Green I ist ein häufig verwendeter fluoreszierender DNA-Bindungsfarbstoff, der an alle doppelsträngigen DNA bindet. Der Nachweis wird durch Messung des Anstiegs der Fluoreszenz während des Zyklus überwacht. SYBR^® Green I hat ein Anregungs- und Emissionsmaximum von 494 nm bzw. 521 nm. Die Spezifität unseres SYBR^® Green-basierten qPCR-Nachweises wird durch den Einsatz einer Hot-Start-vermittelten Taq-Polymerase wie JumpStart™ Taq erheblich verbessert.

Art.-Nr.	Produktname	Merkmale
KCQS02	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ mit ROX™	Für Applied Biosystems® (ABI) Geräte
KCQS01	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low ROX™	Für Applied Biosystems® (ABI) und Stratagene® Geräte
KCQS00	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™	Für Bio-Rad®, Cepheid®, Eppendorf®, Illumina®, Corbett® und Roche® Systeme
KCQS03	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ iQ™	Mit Fluorescein für Bio-Rad® Systeme
S4438	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™	Für quantitative PCR, MgCI2 in Puffer
S5193	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™	Für quantitative PCR, ohne MgCl2 im Puffer
S9194	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ für Hochdurchsatz-qPCR	SYBR® Green qPCR-Reagenz mit passivem Referenzfarbstoff
S1816	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ für die quantitative PCR	Capillary Formulation SYBR® Green qPCR-Reagenz für Roche LightCycler® Kapillarsysteme
SFUKB	KAPA SYBR® FAST qPCR Mastermix, Universal	Konsistente Ermittlung von schwierigen Zielen und Zielen mit niedriger Kopienzahl Vollständige Echtzeit-PCR in nur 40 Minuten
FSUSGMMRO	FastStart Universal SYBR® Green Master (Rox)	Für die Amplifikation und den Nachweis jedes beliebigen DNA- oder cDNA-Ziels, einschließlich GC- oder AT-reicher Ziele Enthält dUTP zur Vermeidung von Kontaminationsverschleppungen
L6544	LuminoCt® SYBR® Green qPCR ReadyMix™	SYBR® Green für schnelle quantitative PCR mit Assay-Ergebnissen in nur 25 Minuten Mit einem separaten Fläschchen ROX Die Optimierung von Assay-Parametern ist praktisch nicht mehr erforderlich

In diesem kurzen Video erfahren Sie mehr über SYBR^® Green-basierte qPCR.

MicroRNA-basierte RT-qPCR

In unserer MystiCq^® Produktlinie finden Sie die microRNA-Produkte für die reverse Transkription, die Sie benötigen.

MystiCq^® MicroRNA RT-qPCR-SystemR

MystiCq^® microRNA-Reagenzien bieten einen vollständigen SYBR® Green RT-qPCR-Workflow für die Quantifizierung der Expression in nur drei Schritten:

1. Isolierung
2. cDNA-Synthese
3. Quantifizierung durch Amplifikation

Erfahren Sie mehr über den MystiCq^®-Workflow auf unserer MystiCq^®-Produktseite. Diese Produkte zeichnen sich durch folgende Merkmale aus:

• Über 1.400 vordefinierte und im Nasslabor getestete Primerpaare, die nur auf reife microRNA abzielen
• Konvertierung aller microRNA, wodurch nahezu unbegrenzte Messwerte aus einer einzelnen Probe möglich werden
• Auswahl von drei verschiedenen Produkten für die Isolierung von microRNA

 

qPCR-Assay-Designs und Reagenzien für die SARS-CoV-2-Forschung

Wir setzen uns dafür ein, Forschenden zuverlässige Informationen und Tools zur Verfügung zu stellen, um den Kampf gegen COVID-19 (SARS-CoV-2) zu unterstützen. Als Reaktion auf den Bedarf der Wissenschaftsgemeinschaft an SARS-CoV-2-spezifischen Reagenzien und Protokollen haben unsere Wissenschaftler die RNA-basierten einstufigen RT-qPCR-Kits für den SARS-CoV-2-Zielnachweis evaluiert. Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.

Versuchsaufbau und Methoden

Dieser Versuch wurde durchgeführt, um festzustellen, ob unsere einstufigen RT-qPCR-Kits SARS-CoV-2 nachweisen können. Der Test wurde nach dem CDC-Protokoll für den SARS-CoV-2-Nachweis durchgeführt, wobei synthetisierte SARS-Cov-2-RNA als Template verwendet wurde, verdünnt in 10⁵, 10⁴, 10³, 10² und 10 Kopien. Die Testprobe enthielt das Template, die Reagenzien aus jedem Kit, zielspezifische DNA-Primer / TaqMan^® Sonden-Sets für N1 und N2 (N, Nukleokapsid-Gen). NTC-Proben (Negativkontrolle) wurden ebenfalls in jeden Assay einbezogen.

Primer Ziel	F Primer 5'-3‘	R Primer, 5'-3‘	Sonde	Amplikon größe
N1	GACCCCAAAATCAGCGAAAT	TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG	5'-FAM-ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3'	71 bp
N2	TTACAAACATTGGCCGCAAA	GCGCGACATTCCGAAGAA	5'-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3'	67 bp

Tabelle 2. Die Primer- und Sonden-Sets für den spezifischen Nachweis von SARS-CoV-2 (N1- und N2-Assays). Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.

Testergebnisse

A: N1-Assay

B: N2-Assay

Abbildung 2. SARS-CoV-2-Nachweisassays unter Verwendung von ReadyMix™ für die quantitative RT-PCR (Art. Nr. QR200) für die Primerziele N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B).

Die SARS-CoV-2-Nachweisassays N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B) in Abbildung 2 wurden mit dem ReadyMix™ für die quantitative RT-PCR (Art. Nr. QR200) unter Verwendung synthetisierter SARS-CoV-2-RNA als Template durchgeführt. Beide Assays wiesen eine Empfindlichkeit von nur 10² Kopien des Templates auf. Bei NTC-Proben wurde keine Amplifikation beobachtet

A: N1-Assay

B: N2-Assay

Abbildung 3. SARS-CoV-2-Nachweisassays unter Verwendung von KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ (Art. Nr. KCQS07) für Primerziele N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B)

Die SARS-CoV-2-Nachweisassays N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B) in Abbildung 3 wurden mit dem KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ (Art. Nr. KCQS07) unter Verwendung synthetisierter SARS-CoV-2-RNA als Template durchgeführt. Beide Assays wiesen eine Empfindlichkeit von nur 10 Kopien des Templates auf. Bei NTC-Proben wurde keine Amplifikation beobachtet.

A: N1-Assay

B: N2-Assay

Abbildung 4. SARS-CoV-2-Nachweisassays unter Verwendung des KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Mastermix (2X) Universal-Kits (Art. Nr. KK4752) für Primerziele N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B).

Die SARS-CoV-2-Nachweisassays N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B) in Abbildung 4 wurden mit dem KAPA-PROBE-FAST One-Step-qRT-PCR-Mastermix (2X) Universal-Kit (Art.-Nr. KK4752) unter Verwendung synthetisierter SARS-CoV-2-RNA als Template durchgeführt. Beide Assays wiesen eine Empfindlichkeit von nur 10² Kopien des Templates auf. Bei NTC-Proben wurde keine Amplifikation beobachtet.

A: N1-Assay

B: N2-Assay

Abbildung 5. SARS-CoV-2-Nachweisassays unter Verwendung von ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit (Art. Nr. RK20407) für Primerziele N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B)

Die SARS-CoV-2-Nachweisassays N1 (Grafik A) und N2 (Grafik B) in Abbildung 5 wurden mit dem ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit (Art. Nr. RK20407) unter Verwendung synthetisierter SARS-CoV-2-RNA als Template durchgeführt. Beide Assays wiesen eine Empfindlichkeit von nur 10 Kopien des Templates auf. Bei NTC-Proben wurde keine Amplifikation beobachtet.

Schlussfolgerung

Die vorgenannten Ergebnisse zeigen, dass unsere One-Step RT-qPCR-Reagenzien und Kits ideal für den SARS-CoV-2 Zielnachweis in der SARS-CoV-2 Forschung sind. Auf der Grundlage dieser Informationen kann der Nachweis in Assays mit den One-Step-RT-qPCR-Reagenzien von nur 100 Kopien oder in einigen Fällen sogar nur 10 Kopien des RNA-Templates erfolgen.

Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.

Die in diesem technischen Artikel vorgestellten unveröffentlichten Daten stammen aus der internen Forschung.

Weitere Informationen über RT-qPCR-Produkte für den Nachweis von SARS-CoV-2 finden Sie unter Sigma-Aldrich.com/covid19.

TRI Reagent^® für die Gesamt-RNA-Isolierung

TRI Reagent^® eignet sich besonders für die schnelle, kostengünstige und effiziente Isolierung von Gesamt-RNA oder die gleichzeitige Isolierung von RNA, DNA und Proteinen aus Proben menschlichen, tierischen, pflanzlichen, Hefe-, bakteriellen und viralen Ursprungs.

Dieses Produkt ist eine Mischung aus Guanidiniumthiocyanat und Phenol in einer einphasigen Lösung. Es löst DNA, RNA und Proteine nach Homogenisierung oder Lyse effektiv aus einer Gewebeprobe. Nach Zugabe von Chloroform oder 1-Brom-3-chlorpropan und anschließender Zentrifugation trennt sich die Mischung in drei Phasen auf: eine wässrige Phase mit der RNA, die Interphase mit der DNA und eine organische Phase mit den Proteinen. Die einzelnen Komponenten können daraus isoliert werden, nachdem die Phasen getrennt worden sind. 1 ml TRI Reagent^® reicht aus, um RNA, DNA und Proteine aus 50-100 mg Gewebe, 5-10 x 106 Zellen oder 10 cm² der Oberfläche einer Kulturschale für Zellen in Monolayer-Zellkultur zu isolieren.

Dies ist eine der effektivsten Methoden zur Isolierung der Gesamt-RNA. Sie kann, beginnend mit der frischen Gewebe- oder Zellprobe, innerhalb von nur einer Stunde durchgeführt werden. Das Verfahren ist sehr effektiv zur Isolierung von RNA-Molekülen aller Arten mit einer Länge von 0,1-15 kb. Die gewonnene RNA ist intakt und nur wenig oder gar nicht mit DNA und Proteinen kontaminiert. Die isolierte RNA kann für Northern Blots, mRNA-Isolierung, In-vitro-Translation, RNase-Schutz-Assays, Klonierung und PCR verwendet werden.

TRI Reagent^® wurde in mehreren Forschungsstudien für die Inaktivierung von Viren und die Extraktion viraler RNA zum Nachweis von SARS-CoV-2 mittels RT-qPCR-Assays verwendet.^1,2,3 Es hat sich als ideal für die Isolierung und Lagerung von mi-RNA bei -80 ⁰C über längere Zeiträume erwiesen.⁴ Es wurde für die Extraktion feliner und caniner Coronavirus-RNA verwendet, die dann in RT-PCR-Assays eingesetzt wurde.^5,6 Es wurde auch für die Isolierung zytoplasmatischer RNA aus mit SARS-CoV infizierten Vero-Zellen verwendet. ⁷

Art.-Nr.	Produktname	Merkmale
T9424	TRI Reagent®	Für die Verarbeitung von Geweben, Zellen in Monolayer-Kultur oder Zellpellets

Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.

Materialien

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Literatur

1. Dimke H, Larsen SL, Skov MN, Larsen H, Hartmeyer GN, Moeller JB. Phenol-chloroform-based RNA purification for detection of SARS-CoV-2 by RT-qPCR: comparison with automated systems. https://doi.org/10.1101/2020.05.26.20099440

2. Alhamlan F, Alqahtani A, Bakheet D, Bohol M, Althawadi S, Mutabagani M, Almaghrabi R, Obeid D. Development and Validation of Two In-house, Low-Cost SARS-CoV-2 Detection Assays. https://doi.org/10.1101/2020.05.18.20105510

3. Toptan T, Hoehl S, Westhaus S, Bojkova D, Berger A, Rotter B, Hoffmeier K, Cinatl J, Ciesek S, Widera M. Optimized qRT-PCR Approach for the Detection of Intra- and Extra-Cellular SARS-CoV-2 RNAs. IJMS. 21(12):4396. https://doi.org/10.3390/ijms21124396

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5. Gunn-Moore DA, Gruffydd-Jones TJ, Harbour DA. 1998. Detection of feline coronaviruses by culture and reverse transcriptase-polymerase chain reaction of blood samples from healthy cats and cats with clinical feline infectious peritonitis. Veterinary Microbiology. 62(3):193-205. https://doi.org/10.1016/s0378-1135(98)00210-7

6. Erles K, Toomey C, Brooks HW, Brownlie J. 2003. Detection of a group 2 coronavirus in dogs with canine infectious respiratory disease. Virology. 310(2):216-223. https://doi.org/10.1016/s0042-6822(03)00160-0

7. Darnell ME, Subbarao K, Feinstone SM, Taylor DR. 2004. Inactivation of the coronavirus that induces severe acute respiratory syndrome, SARS-CoV. Journal of Virological Methods. 121(1):85-91. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2004.06.006

*Bei diesem Artikel handelt es sich um einen Vorabdruck, der noch keinem Peer-Review unterzogen wurde. In dem Artikel wird über neue medizinische Forschung, die noch nicht ausgewertet wurde, berichtet. Er soll daher nicht als Richtschnur für die klinische Praxis dienen.