Assay-Planung für PCR/qPCR/dPCR
A Technical Guide to PCR Technologies
Der gesamte PCR-Workflow ist anfällig für Faktoren, die zur Variabilität beitragen. Viele der variablen Komponenten sind unvermeidbar, wie z. B. die Herkunft der Probe oder die Notwendigkeit einer reversen Transkription. Die Planung des Assays ist ebenfalls sehr variabel, kann den Unterschied zwischen Erfolg und Misserfolg einer PCR ausmachen und trägt auch zur Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit eines Assays bei. Der Prozess der Assay-Planung folgt einem logischen Ablauf: Der erste Schritt besteht darin, den gewünschten Zielort zu bestimmen. In einigen Fällen wird die Sequenz der Oligos durch die Anwendung bestimmt und kann nicht vermieden werden, wie z. B. beim SNP-Nachweis. In anderen Fällen kann das gesamte Gen verwendet werden, z. B. bei der Bestimmung der Anzahl der Kopien. Sobald die ungefähren Testpunkte ausgewählt sind, werden die am besten geeigneten Primer ermittelt und die Modifikationen bestimmt. Wenn Assays im Multiplex-Verfahren durchgeführt werden sollen, ist es wichtig, das Interaktionspotenzial aller Oligos in der Reaktion und auch die relative Abundanz der Ziele zu berücksichtigen. In herausfordernden Situationen, z. B. wenn es darum geht, sehr niedrige Kopienzahlen oder geringe Unterschiede in der Zielkonzentration nachzuweisen, ist es ratsam, mehrere Primerkombinationen auszuwählen und zu testen und dann mit einer geeigneten Sonde zu kombinieren.
Der Prozess der Assay-Planung wird durch den Einsatz einer geeigneten Design-Software erheblich vereinfacht. OligoArchitect bietet zwei Optionen zur Unterstützung der Planung. Die erste Option ist OligoArchitect Online, ein Software-Design-Tool mit einer Vielzahl Optionen. Wenn das Design eine spezielle Fähigkeit erfordert, besteht die zweite Möglichkeit darin, die Planung über OligoArchitect Consultative anzufordern und dabei die Hilfe unserer erfahrenen Molekularbiologen in Anspruch zu nehmen.
Amplikon-Auswahl
Das Amplikon ist der Bereich der Zielsequenz, der analysiert werden soll und von den Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primern umschlossen wird. Die Bestimmung der Amplikongröße hängt zum Teil von der für die Analyse verwendeten Methode ab. Bei der Visualisierung von PCR-Fragmenten durch Gelelektrophorese muss das PCR-Fragment groß genug sein, um mit einem DNA-bindenden Farbstoff effizient angefärbt zu werden, und in den Bereich des gewählten künstlichen Größenmarkers passen. Auch bei der Auflösung des Fragments durch ein Kapillarelektrophoresegerät wird das PCR-Produkt zwischen 100 Basenpaaren und über 2 kb liegen (ggf. begrenzt durch die Enzymleistung).
Bei der Verwendung von qPCR für das endgültige Auslesen wird ein kleineres Amplikon gewählt, um in jedem Zyklus eine genaue Quantifizierung zu gewährleisten. Idealerweise liegt die Länge eines qPCR-Amplikons zwischen 75 und 200 Basen, es sei denn, die Primer liegen aufgrund von Designbeschränkungen außerhalb dieses Bereichs. In der Realität kann die Fragmentgröße durch die Berücksichtigung mehrerer Faktoren bestimmt werden, einschließlich der zu untersuchenden Biologie.
Der Testort kann durch die Ziele des Experiments vorgegeben werden: Idealerweise werden Assays zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge eines mRNA-Ziels an einer Exon-Exon-Verbindung durchgeführt, um den Nachweis kontaminierender gDNA-Sequenzen zu vermeiden. Diese Regionen sind jedoch häufig stark gefaltet; daher muss pragmatisch entschieden werden, ob ein Exon-Überbrückungsassay mit potenziell schlechterer Leistung oder ein exonischer Assay von höherer Qualität vorzuziehen ist. Wenn reichlich mRNA vorhanden ist und von einem Gen mit nur einer Kopie transkribiert wird, ist der Beitrag des Signals aus der gDNA-Kontamination wesentlich geringer als beim Nachweis eines gering abundanten Transkripts eines Gens mit mehreren Kopien. Der Nachweis von SNP erfordert die Platzierung einer Sonde oder des 3' eines Primers über der fehlerhaften Basenpaarung (Mismatch).
Die Analyse von Spleißvarianten erfordert einen auf das Ziel abgestimmten Planungsansatz. In einigen Fällen ist es wünschenswert, alle Spleißvarianten gleichzeitig nachzuweisen. Dies wird einfach durch die Auswahl einer Exongrenze erreicht, die zwischen allen Varianten beibehalten wird. Die Untersuchung unterschiedlicher Expressionen der einzelnen Spleißvarianten erfordert jedoch einen kreativeren Ansatz. In einem Beispielexperiment soll untersucht werden, welche der in Abbildung 6.1 dargestellten alternativen Transkripte exprimiert werden. Da die Exons relativ klein sind, ergibt die Amplifikation über alle Exons ein Produkt mit etwa 300 Basen, wobei kleinere Produkte aus der Amplifikation von Spleißvarianten resultieren. Die Planungsmöglichkeiten für diese Studie wären:
- Entwickeln mehrerer Assays für jede Exon-Exon-Verbindung und Testen aller Proben mit jedem Assay.
- Entwerfen eines Primers am 3‘ von Exon 1 und am 5' von Exon 4. Die Amplifikation eines beliebigen Transkripts, das aus einer beliebigen Exon-Kombination besteht, würde zu einem Amplikon mit einer spezifischen Länge führen. Die Definition des Transkripts würde mit Hilfe einer qPCR Schmelzkurve des SYBR Green I-Farbstoffs nach der Reaktion bestimmt werden.
Abbildung 6.1.Schematische Darstellung eines Gens, das in vier möglichen Spleißvarianten exprimiert wird. Jede Spleißvariante kann durch das Design spezifischer Primerpaare an jeder Exon-Verbindung oder durch die Amplifikation eines generischen Primerpaares in den Exons 1 und 4 und die Differenzierung der Spleißvarianten mittels qPCR, Schmelzanalyse des SYBR Green I Farbstoffs unterschieden werden.
Im Allgemeinen sind Amplikonsequenzen anhand der folgenden Kriterien zu bewerten:
- Es wird empfohlen, zunächst die Region der Zielsequenz zu bewerten.
- Es ist sicherzustellen, dass keine unerwarteten SNP vorhanden sind. Ein einzelner Mismatch zwischen Primer und Template kann die Schmelztemperatur um bis zu 10 °C senken und damit die Effizienz der PCR beeinträchtigen.
- Vergewissern Sie sich, dass die ausgewählte Sequenz keine Homologie zu einer anderen Sequenz im Genom/Transkriptom der Zielart aufweist. Bei Systemen mit mehreren Organismen als Ziel, z. B. bei der Erkennung von Krankheitserregern, muss die Homologiebestimmung alle Sequenzen umfassen, die in der Probe enthalten sein können.
- Testen des Potenzials der Zielsequenz, eine Sekundärstruktur anzunehmen, indem der Faltungsalgorithmus von OligoArchitect, der ausgewählten Designsoftware oder mfold (http://mfold.rna.albany.edu/) verwendet wird, um die Faltung des Templates bei der gewünschten Primer-Hybridisierungstemperatur zu modellieren. Auswahl der Template-Regionen, die eine prognostizierte offene Struktur aufweisen, indem Stammschleifen-Sekundärstrukturen mit sehr negativen ΔG-Werten vermieden werden. Dies ist ein wichtiger Aspekt bei der Verwendung eines einstufigen reversen Transkriptionsprotokolls und genspezifischer Primer.
- Vermeiden palindromischer Sequenzen und sich wiederholender Regionen.
- Vermeiden von G/C-reichen Bereichen und Anstreben eines GC-Gehalts von etwa 50 %.
- Bei der Planung von Multiplex-Assays sollen die Amplikons in Länge und CG-Gehalt so ähnlich wie möglich sein, um eine verzerrte Amplifikation zu vermeiden.
- Identifizierung von homologen oder heterogenen Regionen (je nach Bedarf) bei der Planung von Assays für Genfamilien. Die Sequenzen werden in diesem Fall aligniert und auf Abschnitte mit geeigneter Konsensussequenz untersucht.
- Bei Transkript-spezifischen Designs (zur Vermeidung des Nachweises von gDNA-Templates) sollen nach Möglichkeit Regionen über einer Exon-Exon-Verbindung als Ziel gesetzt werden.
Transkript-spezifische Amplikonauswahl
Bei der RNA-Aufreinigung wird der Großteil, aber nicht die gesamte DNA aus der Probe entfernt. Um eine DNA-Amplifikation während der RT-qPCR zu vermeiden, ist es ratsam, Primer zu wählen, die entweder ein großes Intron flankieren, das in der mRNA-Sequenz nicht vorhanden ist, oder die eine Exon-Exon-Verbindung überspannen (Abbildung 6.2).
Intron-/Exon-Annotationen für bekannte Gene von vielen Wirbeltieren, Bakterien, Protisten, Pilzen, Pflanzen und wirbellosen Metazoen sind auf der EnsemblGenomes-Website (http://ensemblgenomes.org/) verfügbar. Wenn sowohl genomische als auch cDNA-Sequenzen für das Zielgen öffentlich verfügbar sind, können die Intron-Positionen auch durch eine BLAST-Suche mit der cDNA-Sequenz gegen die genomische Datenbank für den Zielorganismus abgeglichen werden (Abbildung 6.3). Intron 1 in Abbildung 6.3 ist so lang (~6,5 kb), dass die DNA unter herkömmlichen qPCR-Bedingungen oder kontrollierten PCR-Bedingungen nicht amplifiziert werden sollte. Alle anderen Introns sind jedoch relativ kurz (< 1 kb), sodass die DNA während der RT-qPCR wahrscheinlich amplifiziert wird (ein Beispiel finden Sie unter Assay-Optimierung und Validierung). Die Primer sollen entweder Exon-Exon-Verbindungen überspannen, ein langes (mehrere kb) Intron flankieren oder mehrere kleine Introns flankieren.
Abbildung 6.2.Darstellung von (A) Intron-überspannenden und (B) Intron-flankierenden Primern für die RT-PCR. Introns sind rot und Exons grün dargestellt. Die Primer P1 und P2 überspannen ein Intron und die Primer P3 und P4 flankieren ein Intron. Beachten Sie, dass die Primer P1 und P2 nur dann ein PCR-Produkt aus DNA erzeugen, wenn die Hybridisierungstemperatur extrem niedrig ist. P3 und P4 können ein längeres PCR-Produkt aus DNA erzeugen, wenn das Intron kurz ist (~1 kb), aber nicht, wenn es ausreichend lang ist (mehrere kb).
Abbildung 6.3.BLAST-Abgleich der cDNA-Sequenz mit der genomischen DNA-Sequenz. Die vollständige cDNA-Sequenz für Ratten-p53 aus der Genbank (Zugangsnummer NM_030989) wurde für eine megaBLAST-Suche nach identischen Sequenzen im Rattengenom (blastn) verwendet. Die Zuordnung der cDNA zur gDNA auf Chromosom 10 ist dargestellt. Anhand dieser Informationen können die Exons der cDNA an den entsprechenden gDNA-Regionen ausgerichtet werden, und das Primerdesign wird auf Exons ausgerichtet, die durch lange Introns getrennt sind, z. B. Exon 1 und 2.
Methylierungsspezifische Assays
Die DNA-Methylierung ist ein entscheidender Bestandteil der Zelldifferenzierung und bewirkt, dass die Genexpression auf stabile Weise verändert wird. Methylierung ist wichtig für die normale Entwicklung in höheren Organismen und kann vererbt werden. Bei der Genregulation durch DNA-Methylierung wird eine Methylgruppe an Position 5 des Cytosin-Pyrimidin-Rings oder an Stickstoff 6 des Adenin-Purin-Rings angehängt. In adulten somatischen Geweben erfolgt die DNA-Methylierung in der Regel in einem CpG-Dinukleotid-Kontext, während in embryonalen Stammzellen eine Nicht-CpG-Methylierung vorherrscht. Methylierungsspezifische Assays erfordern die Identifizierung von CpG-Inseln innerhalb der Sequenz, häufig in der Promoter-Region des Gens. Diese Informationen werden bei Verwendung von Beacon Designer (Premier Biosoft) automatisch ermittelt und sind unter http://www.mybioinfo.info/index.php verfügbar.
Primer-Planung
Die in diesem Kapitel beschriebenen allgemeinen Vorschläge für die Planung von Primern und Sonden sind auf zahlreiche Anwendungen anwendbar, darunter Genexpressionsstudien, SNP-Nachweis, Methylierungsnachweisstudien, Kopienzahlbestimmung, Überwachung der Viruslast und Quantifizierung von Spleißvarianten. Es gibt jedoch für jede Anwendung auch spezifische Designüberlegungen, die separat erörtert werden.
Allgemeine Planungskriterien für Primer
Für die meisten Anwendungen sind die Primer so konzipiert, dass sie vollständig komplementär zu den DNA-Template-Sequenzen sind, die für das Priming vorgesehen sind. Zu den grundlegenden Überlegungen für die Planung von PCR-Primern gehören:
- Die Primer sind in der Regel 20-24 Nukleotide lang und haben eine Schmelztemperatur (Tm) von etwa 60 °C (59±2 °C) für qPCR, können aber bei herkömmlicher PCR variieren (55±5 °C). Spezifische Anwendungen können Änderungen der Primerlänge und Tm erfordern.
- Die Primerpaare sollen einen GC-Gehalt von 40-60 % aufweisen und keine signifikante Sekundärstruktur besitzen.
- Primer sollen nicht zu sich selbst oder zu Partner-Primern komplementär sein, insbesondere am 3'-Ende. Dadurch wird das Potenzial für die Bildung von Primer-Dimer-Produkten während der Amplifikation reduziert.
- 3'-Klemmung ist zu vermeiden (untersuchen Sie die 5 Basen der 3' und akzeptieren Sie 3 davon als A oder T und 2 als G oder C).
- Durchläufe desselben Nukleotids mit mehr als 4 Wiederholungen oder palindromischen Regionen sind zu vermeiden.
SNP-spezifische Primer
In einigen Fällen, z. B. bei der Planung von Einzelnukleotidpolymorphismus-Assays (SNP), gibt es keine Flexibilität für den Ort des Assays und die umgebende Sequenz beeinflusst auch die Sequenz der ausgewählten Oligos. Die Erkenntnis, dass ein Zusammenhang zwischen klinischen Erkrankungen und sowohl keimbahnspezifischen als auch erworbenen somatischen SNP besteht, treibt die Entwicklung immer empfindlicherer und spezifischerer Nachweissysteme weiter voran. Dies spiegelt die schwierige Natur der SNP-Diskriminierung mittels Oligohybridisierung wider. Die Herausforderung liegt in der unterschiedlichen Destabilisierung der verschiedenen fehlerhaften Basenpaarungen. Während G:A, C:T und T:T eine stark destabilisierende Wirkung haben können, sind G:T und C:A viel schwächer, da sich Wasserstoffbrückenbindungen bilden können und es daher schwierig ist, diese Paarungen von den natürlichen G:C und T:A zu unterscheiden. Bei vielen Systemen handelt es sich um Anpassungen des amplifikationsrefrektären Mutationssystems (ARMS)1, das weit verbreitet ist und beim Screening auf Mukoviszidose-Mutationen2 eine wichtige Rolle gespielt hat. ARMS-Primer sind 30 Basen lang (längere Primer mit bis zu 60 Basen sind möglich). Die Base am 3‘ ist SNP-spezifisch und daher spezifisch für die Zielsequenz (normale oder mutierte Base). An der vorletzten Position wird eine zusätzliche fehlerhafte Basenpaarung eingefügt. Diese wird unter Berücksichtigung der benachbarten Basen und des SNP-Mismatch bestimmt (Tabelle 6.1, übernommen von Little, 2001).
Nachdruck mit Genehmigung von Current Protocols in Human Genetics. Little, S. 2001. Amplification-Refractory Mutation System (ARMS) Analysis of Point Mutations. Curr. Protoc. Hum. Genet. 7:9.8.1–9.8.12.
Weitere Forschergruppen haben ähnliche Ideen verwendet und den Nutzen der Einführung von fehlerhaften Basenpaarungen an den Positionen N-2 und N-3 in den Primern nachgewiesen. Liu et al.3 haben eine eingehende Analyse der relativen Positionen von fehlerhaften Basenpaarungen für den größten Destabilisierungseffekt und damit die höchste Spezifität durchgeführt.
Multiplex-PCR
Die gleichzeitige Amplifikation mehrerer Ziele in der Multiplex-PCR ist erforderlich, wenn der Durchsatz durch mehr PCR pro Röhrchen erhöht oder Probenmaterial eingespart werden soll. Die Planung des Primers ist der wichtigste Faktor für eine erfolgreiche Multiplex-PCR. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass die allgemeinen Richtlinien befolgt werden und dass die Kompatibilität aller Primer (und Sonden), die in die Reaktion einbezogen werden sollen, überprüft wird. In einigen Fällen kann es von Vorteil sein, etwas längere Primer mit einer Tm von etwa 65 °C zu verwenden. Wenn die resultierenden Amplikons auf der Grundlage der Größendiskriminierung analysiert werden sollen, muss das Auflösungsvermögen der Analyse in der Planung des Assays berücksichtigt werden. Beim Versuch, mehrere Ziele mittels qPCR zu quantifizieren, sollen die Amplikons so ähnlich wie möglich sein, um Amplifikationsverzerrungen zu vermeiden. Zusätzlich zu den Primern ist es wichtig, dass das Template keine stabile Sekundärstruktur annehmen kann, da dies die PCR behindern würde. Wenn bekannt ist, dass die Ziele in sehr unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen, kann es von Vorteil sein, einen Blockierungsprimer für das hoch konzentrierte Ziel zu verwenden, um den genauen Nachweis des Ziels mit der niedrigeren Konzentration4 zu erleichtern.
Quantifizierung nicht-codierender RNA
Im Gegensatz zum codierenden Genom wird angenommen, dass ~97 % des menschlichen Transkriptoms aus nicht-codierender RNA (ncRNA)5;6,7 besteht. Ein Mitglied dieser Familie ist die lange, nicht-codierende RNA, die als eine Klasse regulatorischer RNA-Moleküle beschrieben wird. Diese Moleküle spielen eine Rolle in der Epigenetik, der Entwicklung, bei Krebs und in grundlegenden biologischen Prozessen8,9. Lange ncRNA werden traditionell als aus RNA-Strängen mit mindestens 200 Basen bestehend definiert10,11,12. Das bedeutet, dass nach der Erfassung der Amplikonlänge bei der Entwicklung dieser Ziele (abgesehen von den bereits genannten) keine besonderen Überlegungen mehr angestellt werden müssen.
Im Gegensatz dazu stellen die Mitglieder der Familie der mikroRNA (miRNA) erhebliche Herausforderungen an die Planung. Es handelt sich dabei um kurze, nicht-codierende RNA (sncRNA) mit 21-23 nt, die in einem komplexen Zellprozess in mehreren Stufen der Transkriptverarbeitung produziert werden. MikroRNA regulieren die Proteintranslation negativ, indem sie an das Transkript binden (überprüft in Kato et al., 200813) und die Bildung des RNA-induzierten Silencing-Komplexes (RISC)14 induzieren. Kommerzielle Assays wie die MystiCq® Linie sind eine willkommene Lösung für die Herausforderungen, die miRNA bei der Planung mit sich bringt. Es gibt mehrere Vorschläge für qPCR zur miRNA-Analyse15 und für die Untersuchung von Organismen, für die es keine kommerziellen Produkte gibt, gibt es mehrere Publikationen, in denen mögliche Lösungen beschrieben werden. Viele dieser Methoden beruhen auf dem Hinzufügen von Basen zur ursprünglichen miRNA durch Ligation eines Adapters (Kapitel 22, Casoldi, et al., in PCR Technologies; Current Innovations ed Nolan16) oder durch Hinzufügen eines Poly-A-Schwanzes unter Verwendung von PolyA-Polymerase (PAP)17. Das Hinzufügen eines Tags zu jedem der miRNA-spezifischen Primer ermöglicht eine Optimierung der Hybridisierungs-Tm und es hat sich gezeigt, dass Reaktionen, die DNA-Primer enthalten, effizienter sind als solche, die mit verbrückter Nukleinsäure18 dotiert sind. In diesem Bericht wurden DNA-Primer, die spezifisch für miRNA sind, unter Verwendung herkömmlicher PCR-Primer-Leitlinien mit zusätzlichen Überlegungen entworfen:
- Untersuchen der miRNA-Sequenz und außer Acht lassen aller terminalen A-Basen an 3'. • Identifizieren der Vorwärtsprimer als längster Abschnitt der Sequenz von 5' bis zu den terminalen 4 Basen von 3' (ohne die vorgenannten identifizierten A-Basen).
- Eine der beiden Basen am 3' des Vorwärtsprimers soll vorzugsweise A oder T sein.
- Die 3 Basen am 3' sollen vorzugsweise 1 oder 2 A oder T enthalten.
- Die 5 Basen am 3' sollen vorzugsweise 2-3 A oder T enthalten.
- Analysieren Sie die Tm des Vorwärtsprimers mit einem Nächster-Nachbar-Algorithmus. Liegt dieser Wert unter 59 °C, fügen Sie die folgenden Basen in der angegebenen Reihenfolge zum 5' hinzu und berechnen Sie Tm nach jeder Zugabe: G,A,C,G,C (was zu einem Primer der Form CGCAGN18 führt, wobei N die miRNA-spezifischen Basen sind). Wählen Sie den kürzesten Primer, dessen Tm am nächsten bei 59 °C liegt. Liegt der Wert über 59 °C, entfernen Sie 5'-Basen und berechnen Sie Tm nach jeder entfernten Base. Wählen Sie den längsten Primer, dessen Tm am nächsten bei 59 °C liegt.
- Wählen Sie die 3'-Basen für den Rückwärtsprimer und achten Sie darauf, dass diese nicht komplementär zum Vorwärtsprimer sind. Bewerten Sie die terminalen 5 Basen wie für den Vorwärtsprimer beschrieben.
- Fügen Sie dem Primer 15×T hinzu (z. B. 5’ T15 N5 3’).
- Analysieren Sie die Tm des Vorwärtsprimers mit einem Nächster-Nachbar-Algorithmus. Liegt dieser Wert unter 59 °C fügen Sie die folgenden Basen des Primers in der angegebenen Reihenfolge zum 5' hinzu und berechnen Sie Tm nach jeder Zugabe: G,A,C,C, T,G,G,A,C, C (was zu einem Primer der Form CAGGTCCAG T15 N5 führt, wobei N die miRNA-spezifischen Basen sind). Wählen Sie den kürzesten Primer, dessen Tm am nächsten bei 59 °C liegt.
- Der RT-Primer lautet CAGCTCCAG T15 V N (wobei V=A, C und G und N=A,C,G,T).
Beispiel für eine Primer-Planung
Da die Zielsequenzen die Primer-Sequenzen vorgeben, ist es nicht immer möglich, die gewünschten Planungskriterien zu erreichen. Daher werden Kompromisse bei der Assay-Planung durch assayspezifische Optimierung überwunden. Einige PCR-Ziele erfordern eine spezielle Verarbeitung, bevor ein erfolgreicher Assay geplant werden kann. Ein häufig auftretender Fall betrifft den Nachweis von Pathogenen, einschließlich Viren. Es ist bekannt, dass viele Viren ein hohes Maß an Variabilität an bestimmten Stellen ihres Genoms aufweisen. Ein gutes Beispiel ist das Hepatitis-B-Virus. Um einen erfolgreichen qPCR-Test gegen die bekannten HBV-Varianten19 zu entwickeln, war es in einer vor kurzem durchgeführten Studie erforderlich, eine umfassende Anpassung aller verfügbaren HBV-Genomsequenzen durchzuführen. Mehrere hundert Sequenzen wurden mit ClustalW verglichen, um signifikante Abschnitte der Konsensussequenz zu finden, die für ein generisches Assay-Design verwendet werden können. Ein Ausschnitt des Anpassungsergebnisses ist in Abbildung 6.4 dargestellt. Die Sternchen (*) stehen für die Nukleotid-Übereinstimmungen, die bei der Analyse aller Genome gefunden wurden (eine große Anzahl anderer Sequenzen, die Teil dieses Alignments waren, sind aus Platzgründen nicht dargestellt).
Abbildung 6.4.Partielle ClustalW-Analyse von HBV-Genomdaten. Alle bekannten HBV-Genomsequenzen wurden anhand von ClustalW abgestimmt und konservierte Nukleotide identifiziert (*)
Bei der Entwicklung von Primern und Sonden kann es in derartigen Situationen erforderlich sein, Oligos zu verwenden, die gemischte Basen enthalten, auch bekannt als "Wobbles" oder degenerierte Basen. Betrachten Sie zum Beispiel die Details der Konsensussequenz für HBV (Abbildung 6.5).
Abbildung 6.5.Ausgewählter Bereich des HBV-Alignments mit Konsensusregionen
Für einen Primer ist eine Region von etwa dreiundzwanzig Basen erforderlich. In diesem Fall ist die tatsächliche Sequenz dieser dreiundzwanzig Basen umfassenden Region unter Berücksichtigung aller möglichen Sequenzen für alle HBV-Genome in Abbildung 6.6 dargestellt:
Abbildung 6.6.Die Permutationen der Primer-Sequenz für die Berücksichtigung aller Basenoptionen für die ausgewählte Konsensus-Primer-Region.
Die Positionen der mehrdeutigen Basen können mit Hilfe von Standard-Ein-Buchstaben-Codes für gemischte Basen dargestellt werden (Tabelle 6.3). Wenn diese auf die in den Abbildungen 6.5 und 6.6 dargestellte Sequenz angewendet werden, kann das Oligo wie in Abbildung 6.7 beschrieben werden.
A = Adenosin, C = Cytidin, G = Guanosin, T = Thymidin
Abbildung 6.7.Die uneindeutigen Basen der Oligo-Konsensusregion werden durch Standardcodes mit Einzelbuchstaben dargestellt.
Es ist unwahrscheinlich, dass diese Option zu einem erfolgreichen PCR-Primer führt, da zusätzliche Überlegungen hinsichtlich der hohen Anzahl degenerierter Basen angestellt werden müssen. Insbesondere würde ein synthetisches Oligo, das mit dieser Sequenz hergestellt wird, in der Tat eine Mischung aller möglichen Einzelbasensequenzen ergeben. Die Anzahl der möglichen, individuellen Primer-Sequenzen wird durch Multiplikation der einzelnen Basenzahlen an jeder Position berechnet. Für diese Sequenz bedeutet dies 1×2×1×1×2×1×1×2×2×1×3×2×1×2×2×2×2×1×1×2×2×1×1×1 = 6144 mögliche individuelle Oligos. Daher wird die effektive Konzentration jedes spezifischen Oligos in der Reaktion proportional reduziert. Empirische Analysen haben gezeigt, dass die Anzahl der verschiedenen Sequenzpermutationen in einem Primer nicht mehr als 512 betragen sollte, daher wäre dieses Beispiel kein optimaler Primer für degenerierte Basen. Eine Umgestaltung an einem anderen Ort wäre eine mögliche Lösung. In dem in Abbildung 6.8 dargestellten Beispiel enthält der Primer 2 Basen mit potenziellen fehlerhaften Basenpaarungen. Diese haben jedoch jeweils eine einzige alternative Base, sodass sich in der gemischten Synthese 4 Oligos ergeben und die Wobbles in der 5'-Region des Primers zu finden sind. Diese Faktoren bieten eine wesentlich höhere Erfolgschance als der in Abbildung 6.7 dargestellte Primer.
Abbildung 6.8.Die Sequenz zeigt die Konsensusbasen des Alignments und die mögliche Position des Primers in einer Konsensusregion. Der Konsensusprimer wird durch Wobble-Codes dargestellt.
Bei der Verwendung degenerierter Oligos in der PCR kann ein modifiziertes Amplifikationsprotokoll erforderlich sein. Der Zyklus kann mit 2-5 Zyklen bei einer niedrigen Hybridisierungstemperatur (35-45 °C) begonnen werden. Außerdem soll ein langsamer Anstieg von der Hybridisierungstemperatur auf die Polymerisationstemperatur vorgesehen werden, wobei es etwa 3-5 Minuten dauert, bis die Polymerisationstemperatur erreicht ist. Das Protokoll soll dann mit 25-40 Zyklen bei einer strikteren Hybridisierungstemperatur ohne die Modifikation des Temperaturanstiegs abgeschlossen werden.
Wenn möglich, soll eine Nukleotidheterogenität vermieden werden. Falls es nicht möglich ist, Regionen mit Heterogenität zu vermeiden, was bei schwierigen Zielen oft der Fall ist, kann die Verwendung spezieller Oligomodifikationen wie Inosin und anderer "universeller" Basen wie 5-Nitroindol dazu beitragen, die Komplexität zu verringern und die Zugabe von modifizierenden Gruppen wie verbrückten Nukleinsäuren (siehe Quantitative PCR und digitale PCR-Nachweisverfahren) kann die Leistung verbessern.
Primermodifikationen
Es ist möglich, modifizierte Nukleotide in PCR-Primer einzubauen. Ein gängiges Beispiel ist das Hinzufügen einer verbrückten Nukleinsäure-Base. Verbrückte Nukleinsäure ist ein modifiziertes RNA-Nukleotid. Der Riboseanteil der verbrückten Nukleinsäure ist durch eine zusätzliche Brücke zwischen dem 2'-Sauerstoff und dem 4'-Kohlenstoff modifiziert (Quantitative PCR und digitale PCR-Nachweisverfahren). Die Brücke "verschließt" die Ribose in der 3'-endo-Konformation. Verbrückte Nukleinsäure kann mit DNA- oder RNA-Basen im Oligonukleotid gemischt werden, wenn dies gewünscht ist. Die Modifikation der verbrückten Nukleinsäure führt zu einer erhöhten thermischen Stabilität, sodass kürzere Sonden mit der äquivalenten Tm wie ein längerer, nicht modifizierter äquivalenter Primer entwickelt werden können. Verbrückte Nukleinsäure enthaltende Sequenzen sind spezifischer als Oligos, die nur aus DNA bestehen, und eignen sich ideal für den SNP-Nachweis. Zu weiteren Anwendungen verbrückter Nukleinsäuremodifikationen gehört die Entwicklung von Oligos für die Analyse schwieriger Sequenzen, wie z. B. Viren, bei denen ein hohes Maß an Variabilität die Entwicklung eines generischen Assays erschweren kann22.
Sonden-Design
Wie bei den PCR-Primern hängt auch das Design von qPCR-Sonden weitgehend vom Sequenzkontext und der gewünschten Anwendung ab. Einzelne Sonden, wie doppelt markierte Sonden oder Molecular Beacons, sind in der Regel 20-30 Basen lang. Scorpions® Sonden sind mit 15-25 Basen kürzer. In einem LightCycler- oder FRET-System gibt es zwei Sonden, die Sensor- (Sonde 1) und die Ankersonde (Sonde 2), die sich in unmittelbarer Nähe befinden, getrennt durch 1-5 Basen.
- Bei der Verwendung von doppelt markierten Sonden soll die Tm 7 °C bis 10 °C höher sein als die der Primer, um sicherzustellen, dass die Sonde an das Ziel gebunden hat, bevor die Primer hybridisieren und verlängert werden. Dies gilt auch für die beiden FRET-Sonden in der Reaktion. Beim SNP-Nachweis befindet sich die Sensorsonde (Sonde 1) über der Stelle der fehlerhaften Basenpaarung, wobei die terminalen 3 Basen der Sonde vermieden werden, und hat eine niedrigere Tm (etwa 5 °C) als die Ankersonde (Sonde 2). Scorpions® Sonden stellen die Ausnahme von dieser Empfehlung dar, da die Sonde eher nach der Verlängerung an das neu synthetisierte Template bindet und nicht vorher, wie bei anderen Sondensystemen.
- Bei quantitativen Studien mit doppelt markierten Sonden soll die Sonde in der Nähe des 3'-Endes des Vorwärtsprimers positioniert werden, aber nicht überlappen (etwa fünf Basen); für den SNP-Nachweis wird eine doppelt markierte Sonde oder ein Molecular Beacon in der Mitte des Amplikons und der SNP in der Mitte der Sonde positioniert.
- Vermeiden Sie ein Guanidin am 5'-Ende der Sonden in der Nähe des Reporters, da dies ein Quenching verursacht.
- Achten Sie darauf, dass die Sondensequenz eine geringere Anzahl G als C enthält.
- Vermeiden Sie Läufe mit der gleichen Base (< 4) und palindromische Sequenzen.
- Stellen Sie sicher, dass die Sonde keine Sekundärstruktur annehmen kann.
- Stellen Sie sicher, dass die Sonde nicht mit den Primern hybridisieren kann.
- Bei der Planung von Sonden für Multiplex-Reaktionen ist darauf zu achten, dass es keine potenziellen Wechselwirkungen zwischen den Sonden und Primern gibt.
Molecular Beacons
Nachdem eine geeignete Sondenregion ausgewählt wurde, werden komplementäre Stämme an das 5'- und 3'-Ende angefügt, um die Molecular Beacon-Struktur zu erzeugen20. Das nachstehende Beispiel zeigt das Hinzufügen einer Stammsequenz (in rot) zu einer doppelt markierten Sonde zur Erzeugung eines Molecular Beacon (Abbildung 6.9 nach Thelwell 200021).
Abbildung 6.9.Anpassung eines Assays doppelt markierter Sonden an ein Molecular-Beacon-Format. Nucleic acids research von Oxford University Press. Nachdruck mit Genehmigung der Oxford University Press bei Wiederverwendung in einem Buch/e-Buch über das Copyright Clearance Center.
Scorpions® Sonden
Bei der Scorpions® Sonde muss die Sonde mit einem Vorwärtsprimer so zusammengesetzt werden, dass sie die folgende Struktur annimmt: 5' Farbstoffstamm-Sonde-Stamm-Quencher-Blocker-Primer. Primer und Sonde müssen sich auf entgegengesetzten Strängen befinden, da die Sonde an das neu erstellte Template bindet, das sich auf demselben Strang wie der Primer befindet. Das Beispiel in Abbildung 6.10 stellt das Hinzufügen von Marker, Quencher, PCR-Blocker und Stammsequenzen zu einer doppelt markierten Sonde zwecks Erstellung einer Scorpions® Sonde (nach Thelwell 200021) dar.
Abbildung 6.10.Anpassung eines Assays doppelt markierter Sonden an ein Scorpions® Sondenformat. Nucleic acids research von Oxford University Press. Nachdruck mit Genehmigung der Oxford University Press bei Wiederverwendung in einem Buch/e-Buch über das Copyright Clearance Center.
Sondenmodifikationen
Wenn sich die Sonden über einem Sequenzbereich mit unerwünschter Heterogenität befinden, werden uneindeutige Basen, wie bei den PCR-Primern beschrieben, behandelt. In ähnlicher Weise kann verbrückte Nukleinsäure aus denselben Gründen zu Sonden hinzugefügt werden, wie es bei Primern der Fall ist.
Das 5'-Ende einer doppelt markierten Sonde, eines Molecular Beacons oder einer Scorpions® Sonde ist mit einem Fluorophor markiert, in der Regel 6-FAM™ für Einzel-Assays oder beim Multiplexing, wobei diese normalerweise in der Reihenfolge FAM, HEX™/JOE™, Cyanin 5 gewählt werden (es ist wichtig, die Kompatibilität der Markierung mit dem Gerät zu bestimmen). Das 3'-Ende einer doppelt markierten Sonde oder eines Molecular Beacon und das 3'-Ende der internen Stammregion einer Scorpions® Sonde sind mit einem Quencher-Molekül modifiziert. In der Vergangenheit wurde der Farbstoff TAMRA als Akzeptor für FAM-Emissionen verwendet, was zu einem FAM-Quenching führte. Die Entwicklungen in der Dark-Quencher-Technologie haben zu einer weit verbreiteten Verwendung von Black Hole Quenchers™ und der kürzlich erfolgten Einführung unserer Onyx Quencher™ geführt (siehe Quantitative PCR und digitale PCR-Nachweismethoden).
Template-Kontrollen
Ein Vorteil der Verwendung relativ kurzer Amplikons, die in der Regel weniger als 150 Basen umfassen, besteht darin, dass es mit ihnen möglich ist, ein langes Oligonukleotid zu synthetisieren, das als synthetisches Amplifikationsziel verwendet werden kann. Die Verwendung eines solchen Ziels kann bei der Entwicklung und Optimierung von Assays unterstützend wirken, bei denen das beabsichtigte Ziel selten oder knapp ist, z. B. beim Hemmungskontrolltest SPUD23 (siehe Anhang A) oder bei Studien zum Infektionserregernachweis19.
Oligo-Synthese und Handhabung
Bei der Bestellung kundenspezifischer Oligos zur Verwendung in PCR-Anwendungen müssen Entscheidungen hinsichtlich der gewünschten Ausbeute/des gewünschten Umfangs der Synthese, der Reinheit und der erforderlichen Modifikationen getroffen werden. Jeder dieser Faktoren wirkt sich auf den anderen aus, z. B. führt ein höherer Aufreinigungsgrad zu einer besseren Qualität des Oligonukleotids, resultiert allerdings in einer geringeren Gesamtausbeute. Die Tabellen 6.4, 6.5 und 6.6 geben Hinweise auf den Synthesemaßstab und die erwartete Ausbeute der von uns hergestellten Oligonukleotide.
Oligonukleotid-Aufreinigung
Bei der DNA-Synthese wird jedes Nukleotid sequentiell an die wachsende Kette gekoppelt, beginnend mit dem 3'-Ende der Sequenz. Bei jedem Kupplungszyklus wird ein kleiner Prozentsatz der Oligoketten nicht verlängert, was zu einer Mischung aus Produkten mit voller Länge und Abbruchsequenzen führt. Nachdem das Oligo vom Trägermaterial abgespalten und die Schutzgruppen entfernt wurden, wird das Produkt durch Aufreinigung in voller Länge von den Abbruchsequenzen getrennt. Im Allgemeinen hängt die für eine bestimmte Anwendung erforderliche Reinheit von der potenziellen Beeinträchtigung durch das Vorhandensein verkürzter Oligomere ab. Für einige Anwendungen ist es entscheidend, dass nur das Oligo mit voller Länge (n) vorhanden ist. Bei anderen, wie z. B. PCR-Primern, hat das Vorhandensein kürzerer Oligos (n-1,n-2,...) ggf. keinen Einfluss auf die Versuchsergebnisse.
Aufreinigung durch Entsalzen
Das Entsalzungsverfahren entfernt verbleibende Nebenprodukte, die bei den Synthese-, Spaltungs- und Entschützungsschritten zurückbleiben.
Für viele Anwendungen, einschließlich PCR, ist die Aufreinigung durch Entsalzen für Oligos akzeptabel, die nicht mehr als 35 Basen lang sind, da die überwältigende Abundanz von Oligos mit voller Länge die Beiträge kürzerer Produkte überwiegt. Oligos, die für die Klonierung benötigt werden oder länger als 35 Basen sind, erfordern eine zusätzliche Aufreinigungsmethode, wie z. B. die Umkehrphasen-Filterelement-Aufreinigung (RP1), HPLC oder PAGE (je nach Länge).
Umkehrphasen-Filterelement-Aufreinigung (RP1)
Durch die Trennung auf einem Umkehrphasen-Filterelement wird ein großer Anteil der Abbruchsequenzen entfernt. Der Unterschied in der Hydrophobizität zwischen dem Volllängenprodukt und den Abbruchsequenzen wird als Grundlage für die Trennung verwendet. Während das Oligo mit voller Länge auf der Säule verbleibt, werden die Abbruchsequenzen abgewaschen. Das gewünschte Produkt mit voller Länge wird dann eluiert und aus dem Filterelement entnommen.
Umkehrphasen-HPLC
Mit zunehmender Oligolänge nimmt der Anteil der Abbruchsequenzen tendenziell zu. Nicht alle diese Verunreinigungen werden durch RP1 entfernt. Daher wird für längere Oligos, wie z. B. künstliche Amplikon-Template-Oligos oder markierte Sonden-Oligos, eine HPLC- oder PAGE-Aufreinigung empfohlen. Die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) arbeitet nach dem gleichen Prinzip wie ein Umkehrphasen-Filterelement. Die höhere Auflösung ermöglicht jedoch einen höheren Reinheitsgrad. Die HPLC ist eine effiziente Aufreinigungsmethode für Oligos mit Fluorophoren, wie z. B. qPCR-Sonden, da ihre intrinsische Lipophilie eine hervorragende Trennung des Produkts von Verunreinigungen ermöglicht. Außerdem ist die RP-HPLC aufgrund der Kapazität und der Auflösungseigenschaften der Säule eine Methode der Wahl für größere Maßstäbe. Die auf der Lipophilie basierende Auflösung nimmt mit zunehmender Länge des Oligos ab. Daher wird die RP-HPLC in der Regel nicht für die Aufreinigung von Produkten empfohlen, die länger als 50 Basen sind. Obwohl längere Oligos (bis zu 80 Basen) mit dieser Methode aufgereinigt werden können, können Reinheit und Ausbeute beeinträchtigt werden.
Anionenaustausch-HPLC
Die Trennung durch Anionenaustausch basiert auf der Anzahl der Phosphatgruppen im Molekül. Die Anionenaustausch-Aufreinigungsmethode beinhaltet die Verwendung einer Salzgradienten-Elution auf einer stationären Säule mit quartärer Ammoniumphase oder einer ähnlichen Struktur. Die Auflösung ist hervorragend für die Aufreinigung kleinerer Mengen geeignet. Diese Technik kann mit der Aufreinigung durch RP-HPLC gekoppelt werden, wodurch dem Trennungsprozess eine zweite Dimension hinzugefügt wird. Die Anionenaustausch-HPLC ist durch die Oligolänge begrenzt (normalerweise bis zu 40mers). Je länger die Oligonukleotide sind, desto geringer ist die Auflösung auf der Anionenaustausch-HPLC-Säule und damit auch die Reinheit des Zieloligos.
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
Die Grundlage der PAGE-Trennung ist Ladung über Molekulargewicht, was zu einer guten Größenauflösung führt und eine Reinheit von 95-99 % des Produkts mit voller Länge ergibt. Die Ausbeute bei der PAGE-Methode ist geringer als bei anderen Methoden, was auf die komplexen Verfahren zurückzuführen ist, die für die Extraktion der Oligos aus dem Gel erforderlich sind, sowie auf die Entfernung der großen Mehrheit der verkürzten Produkte. Diese Technik wird empfohlen, wenn ein hoch aufgereinigtes Produkt benötigt wird. PAGE ist die empfohlene Aufreinigungsmethode für längere Oligos (≥ 50 Basen).
* Die Garantie gilt für 20mers oder länger. Kürzere Oligos haben möglicherweise eine geringere OD.
* Die Garantie gilt für 20mers oder länger. Kürzere Oligos haben möglicherweise eine geringere OD.
Hinweis: Modifikationen nach der Synthese können in einer Ausbeute resultieren, die 50 % unter den vorgenannten Werten liegen.
Alle Sonden werden durch RP-HPLC aufgereinigt.
Oligonukleotid-Vorbereitung
Trocken gelieferte DNA-Oligonukleotide sind nach dem Resuspendieren sofort einsatzbereit. Es wird empfohlen, die Oligonukleotide in einem schwachen Puffer wie TE (10 mM Tris, pH 7,5-8,0, 1 mM EDTA) zu resuspendieren. Bei Anwendungen, für die TE nicht geeignet ist, kann steriles nukleasefreies Wasser verwendet werden. Hochwertiges Wasser kann jedoch leicht sauer sein und wird für die langfristige Lagerung von Oligonukleotiden nicht empfohlen.
Eine 100 μM-Stammlösung kann wie folgt hergestellt werden: Nehmen Sie die Anzahl der angegebenen Nanomole (nmol) (Angaben auf dem Röhrchenetikett und/oder dem mit dem Oligo gelieferten Qualitätssicherungsdokument) und multiplizieren sie mit 10. Das Ergebnis ergibt die Flüssigkeitsmenge in Mikroliter, die in das Röhrchen gegeben werden müssen, um eine Endkonzentration von 100 μM zu erreichen. Beträgt die Oligoausbeute beispielsweise 43,5 nmol, so beträgt das hinzuzufügende Volumen für 100 μM Stamm 435 μl. Beachten Sie, dass dies einer Stammlösung von 100 pmol/μl entspricht. Die Stammlösung kann dann abhängig von den Anforderungen der Anwendung weiter verdünnt werden. Für die PCR wird in der Regel eine Arbeitskonzentration von 10 μM oder 20 μM verwendet. Lagern Sie die Stammlösung in Aliquoten bei -20 °C und vermeiden Sie mehrfache Gefrier- und Auftauzyklen.
Literatur
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