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First Strand cDNA-Synthesekit für die RT-PCR (AMV)

sufficient for 30 reactions (including 5 control reactions), kit of 1 (10 components), suitable for RT-PCR, hotstart: no, dNTPs included

• Synonym(e): RT-PCR, cDNA-Synthese
• UNSPSC-Code: 41106313

Eigenschaften

• Verwendung: sufficient for 30 reactions (including 5 control reactions)
• Qualitätsniveau: 100
• Spezifische Aktivität: >50 units/μg protein
• Leistungsmerkmale: dNTPs included; hotstart: no
• Verpackung: kit of 1 (10 components)
• Hersteller/Markenname: Roche
• Parameter: 42 °C optimum reaction temp.
• Methode(n): RT-PCR: suitable
• Aufnahme: purified RNA
• Lagertemp.: −20°C

Beschreibung

Allgemeine Beschreibung

Das First Strand cDNA-Synthesekit wird für die Synthese der Erststrang-cDNA als Startreaktion für die zweistufige RT-PCR verwendet. Das Kit enthält die AMV-Reverse Transkriptase für die Erststrangsynthese, zwei unterschiedliche Primer, unsere PCR-Nukleotidmischung und Neo pa Kontroll-RNA. Durch RT-PCR erzeugte PCR-Produkte können mithilfe von Standardverfahren kloniert werden.

Die Amplifikation von RNA erfordert die Umwandlung des RNA-Substrats in DNA. Dies erfolgt durch die Anwendung einer reversen Transkriptase wie AMV-RT (reverse Transkriptase des aviären Myeloblastis-Virus) oder M-MuLV RT (Moloney-Mausleukämievirus-Reverse Transkriptase). Die resultierende cDNA kann als Template für eine Standard-PCR verwendet werden.
Die AMV-RT synthetisiert den neuen cDNA-Strang an Stellen, die durch die Art des verwendeten Primers bestimmt werden:

• am 3′-Ende der Poly(A)-mRNA, wenn Oligo-p(dT)₁₅als Primer eingesetzt wird,
• an unspezifischen Stellen entlang des mRNA-Templates, wenn der Zufallsprimer p(dN)₆ verwendet wird, oder
• an einer von einem sequenzspezifischen Primer bestimmten Stelle.

Die Anwendung der AMV-RT für die Erststrang-cDNA-Synthese hat gewisse Vorteile. Aufgrund der höheren Thermostabilität dieses Enzyms im Vergleich zu M-MuLV-RT kann die Reaktion bei +42 °C durchgeführt werden, wodurch eine höhere Spezifität und eine bessere Auflösung von Sekundärstrukturen als bei einer Reaktion bei +37 °C erzielt werden kann.

Spezifität

Hitzeinaktivierung: 5 min, 95 °C
AMV-Reverse Transkriptase

Anwendung

Das Erststrang-cDNA-Synthesekit für die RT-PCR (AMV) ist geeignet:

• Zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von RNA-Viren oder anderen RNA-haltigen Mikroorganismen (in Kombination mit PCR)
• Zur quantitativen Bestimmung von mRNA bei der Überwachung der Differenzialexpression einer spezifischen mRNA[1][2]
• Als erster Schritt bei der „Differenzialanzeige von mRNA“[3]
• Zur Erstellung von cDNA-Bibliotheken mit großen Einfügungen und Einfügungen von voller Länge[4]
• Zur quantitativen Polymerasekettenreaktion mit reverser Transkription (RT-qPCR) von RNA in komplementäre DNA.[5][6][7]

Leistungsmerkmale und Vorteile

Robustheit:

• Transkribiert Gesamt-RNA, mRNA und virale RNA sowie schwierig zu transkribierende sekundäre RNA-Strukturen
• Erhalt von cDNA-Transkripten mit bis zu 12 kb
• Höhere Thermostabilität (bis zu 50 °C) und Spezifität als M-MuLV-Reverse Transkriptase
• Eine Reinigung der resultierenden cDNA vor der PCR-Reaktion ist nicht notwendig.

Flexibilität:
Es kann entweder mit sequenzspezifischen Primern, Poly(dT)15-Primern oder beliebigen Primern, p(dN)6 verwendet werden.

Verpackung

1 Kit mit 10 Komponenten.

Qualität

Im cDNA-Synthese-Standardassay werden mindestens 300 ng cDNA synthetisiert (d.h. 30 % Ausbeute), wenn 1,0 μg Neo pa RNA-Template mit 20 μCi [α-³²P]-dCTP (spezifische Aktivität von 3000 Ci/mmol) 60 Minuten bei +42 °C inkubiert wird.

Einheitendefinition

Volumenaktivität: 20 bis 25 U/μl

Sonstige Hinweise

Nur für die Life-Science-Forschung. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren vorgesehen.

Nur Kit-Komponenten

• Reverse Transcriptase AMV
• PCR Nucleotide Mix, pH 8.5 10 mM each
• Reaction Buffer
• MgCl₂ Stock Solution 25 mM
• Gelatin 0.05% (w/v)
• Oligo-p(dT)₁₅ , 0.02 A₂₆₀ units/μl 0.8 μg/μl
• Random Primer p(dN)₆ , 0.04 A₂₆₀ units/μl 1.6 μg/μl
RNase Inhibitor 50 U/μl
Control Neo pa RNA (1.0 kb in length with additional 19-base 3′-poly(A) tail) 0.2 μg/μl
Water, PCR Grade

Alle anzeigen (10)

Sicherheitshinweise

• Lagerklassenschlüssel: 12 - Non Combustible Liquids
• WGK: WGK 1
• Flammpunkt (°F): does not flash
• Flammpunkt (°C): does not flash