PCR-Assay-Optimierung und Validierung

Technischer Leitfaden für PCR-Technologien

Auf dieser Seite

• Optimierung der PCR-Bedingungen
  
• Validierung des Primerdesigns
• Optimierung der Sondenkonzentration
• Optimierung von Reaktionskomponenten und Multiplex-Assays
• Optimierung der Mg2+-Konzentration
• Auswahl der Sondenfluorophore und Quencher
• Leitlinien für die Optimierung der PCR (RT-qPCR) mittels quantitativer reverser Transkription
• Assay-Auswertung

Optimierung der PCR-Bedingungen

Assay-Optimierung und -Validierung sind unerlässlich, selbst bei der Verwendung von Assays, die bereits entwickelt wurden und im Handel erhältlich sind. Eine Optimierung ist erforderlich, um sicherzustellen, dass der Test so empfindlich wie nötig und spezifisch für das Ziel von Interesse ist. Der Nachweis von Krankheitserregern oder die Erstellung von Expressionsprofilen seltener mRNA erfordert zum Beispiel eine hohe Empfindlichkeit; der SNP-Nachweis erfordert eine hohe Spezifität und die Quantifizierung von Viren erfordert sowohl eine hohe Spezifität als auch eine hohe Empfindlichkeit. Assays, die eine hohe Spezifität erfordern, sind besonders anfällig, wenn sie ohne Optimierung und angemessene Kontrollen durchgeführt werden. Wenn mehrere Targets gleichzeitig in Multiplex-Reaktionen nachgewiesen werden sollen, müssen die Assaybedingungen so optimiert werden, dass alle Targets gleichermaßen nachgewiesen werden. Die Validierung liefert die Daten, die erforderlich sind, um die weitere Verwendung des Assays in weiteren Forschungsprojekten zu rechtfertigen¹.

Es gibt eine Reihe von Faktoren, die verändert werden können, um eine optimale Assayleistung zu erzielen und dadurch eine höhere molekulare Empfindlichkeit, Spezifität und Präzision zu erreichen. Assays, die von qualifizierten kommerziellen Anbietern erworben werden, müssen zusätzlich im Labor, in dem sie verwendet werden, validiert werden. Ansprüche bezüglich der Leistung von Assays sollen unter den Bedingungen der Studie, einschließlich der Testproben, der spezifischen Reagenzien und des gewählten Instruments, überprüft werden.

Ein Assay, der so konzipiert wurde, dass alle wünschenswerten Designkriterien erfüllt wurden (Assay-Planung für PCR/qPCR/dPCR), wird voraussichtlich unter einer Vielzahl von Bedingungen gut funktionieren. Für alle Assays gibt es jedoch eine Reihe von optimalen Bedingungen, die vom Gerät, den ausgewählten Reagenzien (Pufferbedingungen), der Primerkonzentration und/oder der Hybridisierungstemperatur (T_a), der Magnesiumkonzentration und sogar der Anstiegsrate abhängen. Da der Assay in der Regel auf einem ausgewählten Gerät und unter Standardpufferbedingungen durchgeführt wird, konzentrieren sich die meisten Optimierungsverfahren auf die Änderung der Primerbindungskinetik unter Verwendung der Primerkonzentration oder der Hybridisierungstemperatur (T_a)/Schmelztemperatur (T_m).

Unabhängig davon, ob es sich bei dem Ziel um DNA (qPCR) oder RNA (RT-qPCR) handelt, tragen die folgenden vorbereitenden Schritte zu einer erfolgreichen Quantifizierung bei:

• Validierung des Primerdesigns
  
• Optimierung der Primer-Konzentrationen
  
• Optimierung der Primer-Hybridisierungstemperatur
• Optimierung der Sondenkonzentration
  
• Optimierung der Reaktionskomponenten und Multiplexbedingungen
  
• Validierung der Leistung mit einer Standardkurve und einer Schmelzkurvenanalyse

Validierung des Primerdesigns

Die Validierung des Primerdesigns ist besonders wichtig, wenn Primer aus einer früheren Veröffentlichung übernommen oder ein im Handel erhältlicher Assay verwendet wird. Das Primerdesign kann unter Berücksichtigung der Anleitung für das Assaydesign in Assay-Planung für PCR/qPCR/dPCR überprüft werden. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, sich zu vergewissern, dass:

• Die Primer homolog zur gewünschten Zielsequenz sind.
  
• Der reverse Komplement-Primer korrekt ist. Prüfen Sie sorgfältig die Reihenfolge der reversen Komplementbasis (unter http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html).
  
• Entsprechende Spleißvarianten erkannt werden.
  
• SNP vermieden werden, sofern sie nicht für den Assay erforderlich sind.
  
• Die Oligos und das Amplikon keine Sekundärstruktur aufweisen.
  
• Ein geringes Potenzial für die Oligos der Reaktion besteht, miteinander zu hybridisieren.

Primer-Dimer

Die Fähigkeit der Primer, miteinander zu hybridisieren, insbesondere am 3'-Ende, kann zur Primerverlängerung während der PCR und zur Bildung von zielunabhängigen Produkten, den sogenannten Primer-Dimeren, führen. Wenn Primer-Dimer-Produkte hergestellt und amplifiziert werden, lenken sie Reaktionskomponenten von der Synthese des gewünschten Produkts ab und verringern so die Effizienz und Empfindlichkeit des Assays. Daher sind Primer-Dimere ein Problem bei Reaktionen, die sowohl auf Sonden als auch auf SYBR Green I-Farbstoff-Nachweisen basieren. Beim farbstoffbasierten Nachweis, wie z. B. SYBR Green I, beeinträchtigen Primer-Dimere auch die Spezifität des Assays, da der unspezifische DNA-bindende Farbstoff an die Primer bindet und zusammen mit dem gewünschten Produkt nachgewiesen wird. Daher sollen Primer, bei denen die Gefahr besteht, dass sie Primer-Dimere bilden, vermieden werden.

Prognose von Primer-Dimeren

Verwenden Sie eine Primer-Design-Software zur Analyse der Duplexbildung, um das Potenzial für die Bildung von Primer-Dimeren zu bestimmen. OligoArchitect liefert Details über die Stärke der Selbstdimer- und Kreuzdimer-Hybridisierung (Abbildung 9.1). Alle 3'-terminalen Dimere, die entweder durch die Hybridisierung des Primers mit sich selbst oder mit seinem Partner gebildet werden, müssen sehr schwach sein (ΔG ≥ -2,0 kcal, Abbildung 9.1).

Wie kann man Primer-Dimere reduzieren?

Jeder Primer mit einem terminalen ΔG < -2,0 kcal und einem verlängerbaren 3'-Ende (5'-Überlappung) soll vermieden werden. Der stärkste Gesamtdimer soll instabil sein (ΔG ≥ -6,0 kcal). Um starke 3'-terminale Dimere zu vermeiden und gleichzeitig die Spezifität zu erhalten, wählen Sie Primer, die 2 G- oder C-Reste in den letzten 5 Basen, 1 G oder C in den letzten 3 Basen und ein A oder T am 3'-Ende aufweisen (Abbildung 9.1).

Abbildung 9.1. Analyse der Primer auf Primer-Dimer-Potenzial. Die Primer-Sequenzen wurden mit der Design-Software OligoArchitect analysiert, um ihre Fähigkeit zur Bildung von Duplexen zu bestimmen. Für die beste Primeroption wird ein Selbstdimer- und Kreuzdimer-Potenzial aufgezeigt. Multiplex qPCR liefert die besten Ergebnisse, wenn alle Primer in der Reaktion ähnliche Schmelztemperaturen aufweisen (Tm-Differenz ≤ 2 °C) und keine starken 3'-Duplexe bilden (ΔG ≥ -2,0 kcal).

Optimierung der Primerkonzentrationen und der Hybridisierungstemperatur (T_a)

Bei der Optimierung der Assay-Bedingungen unter Verwendung der Primer-Konzentration wird ein feststehender T_a-Wert (in der Regel 60 °C) gewählt, und die optimalen Bedingungen für jeden Primer werden unabhängig voneinander untersucht. Dies ist von entscheidender Bedeutung, wenn ein Assay für die Durchführung im Multiplex-Verfahren konzipiert wird, da alle Reaktionen bei der gleichen Hybridisierungstemperatur ablaufen müssen. Und es ist eine Taktik, die auch eingesetzt werden kann, um Assays mit schlechter Leistung zu retten, für die kein alternatives Design zur Verfügung steht. Ein technisch einfacherer Ansatz besteht darin, eine feste Primerkonzentration zu wählen und dann den T_a zu optimieren, indem das beste Ergebnis für diese Primer in Kombination ausgewählt wird. Dies ist der bevorzugte Ansatz bei der Verwendung mehrerer Assays und dem Nachweis von dsDNA-bindenden Farbstoffen wie SYBR^® Green I. Dieser Ansatz erfordert jedoch ein Gerät, das Reaktionsprogramme mit verschiedenen T_a-Optionen gleichzeitig ausführen kann.

Optimierung der Primer-Konzentrationen

Bei der sondenbasierten qPCR werden häufig zufriedenstellende Ergebnisse mit Endkonzentrationen beider Primer von 500 nM und der Sonde von 250 nM erzielt, insbesondere wenn das PCR-Ziel reichlich vorhanden ist und keine maximale Empfindlichkeit erforderlich ist. Etwas niedrigere Primerkonzentrationen zwischen 200 nM und 400 nM sind in der Regel besser bei der Verwendung von SYBR Green I-Farbstoff-basiertem Nachweis geeignet, um unspezifische Amplifikation zu minimieren und Multiplex-Reaktionen zu optimieren. Um zu überprüfen, ob die Standardbedingungen für die Verwendung geeignet sind, führen Sie eine Standardkurvenanalyse durch (siehe Assay-Bewertung). Wenn der Nachweis linear und reproduzierbar ist und der Gradient über dem Bereich der in den Proben erwarteten Zielkonzentrationen von -3,2 und -3,5 liegt, ist eine weitere Optimierung der Primer- und Sondenkonzentrationen möglicherweise nicht erforderlich.

Einige der Anzeichen dafür, dass ein Assay nicht gut optimiert ist, sind mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten und allgemeine Ineffizienz und Unempfindlichkeit. Die Assay-Leistung wird in der Regel über einen Bereich von Primer-Konzentrationen getestet, z. B. von 50-800 nM, wobei jeder Primer in jeder Konzentration verwendet wird (Abbildung 9.2; ein vollständiges Protokoll finden Sie in Anhang A, Protokolle; Primer-Optimierung).

Abbildung 9.2. Beispiel für Primer-Optimierung. Anordnung der 8er-Röhrchenstreifen (oben und links) und der PCR-Platte zum Verdünnen und Dosieren der Primer.

Es wird die Konzentrationskombination gewählt, die den niedrigsten C_q,-Wert, die geringste Variation in den Replikaten und einen negativen NTC-Wert erzielt (Abbildung 9.3)².

Abbildung 9.3. Ergebnisse einer PCR-Primer-Konzentrationsoptimierung aus einem SYBR Green I-Farbstoff-Assay. A) In den gängigen Richtlinien wird empfohlen, eine Vielzahl von Vorwärts- (F) und Rückwärtsprimer-Konzentrationen (R) zu testen. In diesem Beispiel wurden 50 nM bis 600 nM in Kombination getestet, um die optimale Konzentration für den Assay zu ermitteln. In diesem Versuch gibt es aufgrund unterschiedlicher Primerkonzentrationen einen enormen Unterschied im Cq-Wert, wodurch deutlich wird, wie sich dies auf die endgültigen Daten auswirken kann (Daten von Jens Stolte, EMBL). B) In diesem Versuch wird die Optimierung eines gut konzipierten Assays und die Variabilität aufgrund der Primerkonzentration dargestellt. Die 400 nM Vorwärts- und Rückwärtsprimer-Kombination wurde als optimal erachtet, da diese Kombination die niedrigsten Primerkonzentrationen aufwies, die reproduzierbar die frühesten Cq-Werte ergaben und gleichzeitig eine sigmoidale Kurve beibehielten.

Wenn ein Ziel in einer Multiplexreaktion deutlich häufiger vorkommt als die anderen oder wenn ein Primerpaar einen viel niedrigeren C_q-Wert ergibt als die anderen, kann die Amplifikation dieses Ziels die Reaktion dominieren und die Reaktionskomponenten verbrauchen, bevor andere Ziele nachweisbar sind. Die Anpassung der Primerkonzentrationen kann eine ausgewogenere Amplifikation aller Ziele ermöglichen. Um festzustellen, ob solche Anpassungen von Vorteil sind, werden Standardkurven erstellt (siehe Assay-Bewertung), die den Bereich der erwarteten Ziele für jedes Primerpaar allein (Singleplex) und mit allen Primern in Kombination (Multiplex) abdecken. Wenn Multiplex- und Singleplex-Reaktionen ähnliche Ergebnisse liefern, sind die Primerkonzentrationen geeignet. Darüber hinaus kann die Optimierung der Primerkonzentrationen die Ergebnisse verbessern, wenn die Empfindlichkeit bei Multiplex-Reaktionen inakzeptabel ist. Verringern Sie die Primerkonzentrationen für die Primerpaare, die zu niedrigen C_q-Werten führen, und/oder erhöhen Sie die Konzentrationen für diejenigen, die zu hohen Cq-Werten führen, im Bereich von 50-500 nM.

Optimierung der Primer-Hybridisierungstemperatur

Quantitative PCR-Assays werden in der Regel mit zwei- oder dreistufigen Temperaturzyklusprogrammen durchgeführt, die in der Regel 35-40 Zyklen umfassen. Zweistufige Reaktionen wechseln zwischen zwei Temperaturen, in der Regel 95 °C (typischerweise für 10-15 s) und 60 °C (typischerweise für 30-60 s oder 5-10 s unter schnellen Bedingungen). Zweistufige Temperaturreaktionen werden gewählt, wenn Assays mit doppelt markierten Sonden (TaqMan oder Hydrolyse) durchgeführt werden, da die Elongation bei niedriger Temperatur die Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase fördert und die Verdrängung der Sonde verhindert. Dies wäre das bevorzugte Protokoll für zyklische Bedingungen zur Durchführung vieler verschiedener Assays mit den gleichen Parametern. Der Nachteil der zweistufigen Methode besteht jedoch darin, dass sie die möglichen Optionen für das Primerdesign einschränkt und die Assay-Optimierung allein auf die Primerkonzentration beschränkt, da keine Optimierung der Hybridisierungstemperatur (_a) möglich ist.

Ein dreistufiges Zyklusprotokoll ist vorzuziehen, wenn die Zielsequenzen komplex sind und entweder die gewählten Primer schwer zu optimieren sind oder das verwendete Nachweissystem nicht von der Verwendung einer Hydrolysesonde abhängig ist. Dreistufige Strategien wechseln zwischen: 95 °C (üblicherweise für 10 s), einer Hybridisierungstemperatur (zwischen 55 °C und 65 °C, üblicherweise für 10-20 s oder 5 s unter schnellen Bedingungen) und 72 °C (typischerweise für 20-30 s oder 15-20 s unter schnellen Bedingungen). In diesem Fall kann der T_a-Wert mit Hilfe des folgenden Protokolls optimiert werden, um die Assay-Leistung weiter zu verbessern:

• Beginnen Sie am unteren Ende des zu testenden T_a-Bereichs, der durch den T_a-Wert der Primer bestimmt wird, und erhöhen Sie die Temperatur in kleinen Schritten (in der Regel wird zwischen 55 °C und 65 °C getestet). Einige Geräte verfügen über Gradientenblöcke, die eine Temperaturoptimierung in einem einzigen Durchgang ermöglichen.
  
• Testen Sie jedes Reaktionsprodukt auf seine Spezifität, entweder durch Post-PCR-Schmelzkurvenanalyse oder Agarose-Gelektrophorese, wie nachstehend beschrieben.
  
• Die optimale Hybridisierungstemperatur ist die Temperatur, die den niedrigsten C_q-Wert, einen negativen NTC-Wert, eine Schmelzkurvenanalyse, die den Nachweis eines spezifischen Produkts aufzeigt, und eine hohe Reproduzierbarkeit zwischen den Wiederholungsreaktionen ergibt.

Wenn die Hybridisierungstemperatur zu niedrig ist, verläuft die Reaktion unspezifisch. Ist die Temperatur jedoch zu hoch, kann die Stringenz die Reaktionseffizienz beeinträchtigen, was zu einer fehlenden Amplifikation oder sehr hohen C_q-Werten, sehr schlechten Ausbeuten und geringer Reproduzierbarkeit führt.

Ein Beispiel für eine Temperaturoptimierung ist in Abbildung 9.4 dargestellt. In diesem Fall (Abbildung 9.4A) wurden identische Reaktionen auf einem Gradienten-PCR-Block durchgeführt, sodass die Hybridisierungstemperatur zwischen 47,8 °C und 71,7 °C lag. Die Hybridisierung bei 64,8 °C und 61,7 °C führt zu identischen C_q-Werten, aber die etwas niedrigere Temperatur führt zu einer höheren Produktausbeute, was sich in einer höheren Endpunktfluoreszenz und einer Reaktion mit offensichtlich höherer Effizienz zeigt (angezeigt durch den Gradienten der Amplifikationskurve). Die absolute Bestimmung der Effizienz erfordert eine Standardkurvenbewertung (siehe Assay-Bewertung) oder die Verwendung von Algorithmen zur Bestimmung der Effizienz in einem einzelnen Röhrchen^3,4. Der zweite Teil der Abbildung (Abbildung 9.4B) zeigt einen Vergleich zwischen dem Verhalten der Primer unter identischen Reaktionsbedingungen, aber in unterschiedlichen Reagenzienmischungen auf. Hier wird deutlich, dass die Pufferzusammensetzung die Reproduzierbarkeit des Assays und den Temperaturbereich, in dem stabile Daten erzielt werden, beeinflusst. Schließlich wurden zwei unabhängige Assays für dasselbe Zielgen entwickelt und diese in jedem Puffer optimiert. Wie aus Abbildung 9.4C hervorgeht, benötigte jeder Puffer eine andere optimale Temperatur, um vergleichbare C_q-Daten von den beiden Primerpaaren zu erhalten (61,7 °C bei LuminoCt und 58,4 °C bei KiCqStart).

Abbildung 9.4. Primer-Optimierung anhand des Ta-Werts. A) Eine Reihe von Hybridisierungstemperaturen wurde auf identische Reaktionen getestet. Die Hybridisierung bei 64,8 °C und 61,7 °C führt zu identischen Cq-Werten und hoher Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten, aber die etwas niedrigere Temperatur führte zu einer höheren Produktausbeute. B) Zwei identische Reaktionen wurden in verschiedenen Reagenzienmischungen (LuminoCt® SYBR® Green qPCR-ReadyMix™oder KiCqStart® SYBR® Green qPCR-ReadyMix™) angesetzt und ein Primer-Temperaturgradientenlauf durchgeführt. Die optimale Temperatur war bei jeder Mischung unterschiedlich, und es gab weniger Abweichungen zwischen den Daten, wenn die Reaktionen mit KiCqStart-Reagenzien durchgeführt wurden. C) Zwei Primerpaare für das gleiche Ziel (KS und entworfen mit Beacon Designer, BD) wurden in verschiedenen Reaktionsmischungen ausgeführt. Es ist zu erkennen, dass die optimale Hybridisierungstemperatur bei den verschiedenen Reagenzien unterschiedlich ist (61,7 °C bei LuminoCt und 58,4 °C bei KiCqStart), um ähnliche Ergebnisse mit den Primern zu erzielen.

Obwohl die meisten kommerziellen Assays mit Standard-PCR-Assay-Bedingungen geliefert werden, können einzelne Assays von einer weiteren Optimierung profitieren, um Bedingungen zu ermitteln, die für die jeweilige Primerkombination spezifisch sind. Dies kann auf Primer-Dimere, unspezifische Amplifikation oder eine suboptimale Reaktionseffizienz unter den gewählten Standardbedingungen zurückzuführen sein. Nach Abschluss der Optimierung soll die Assay-Effizienz berechnet werden, indem die gewählten Bedingungen auf die Messung einer Reihe von Standards angewendet und eine Standardkurve erstellt wird (Assay-Bewertung). Es ist möglich, dass die Effizienz auch nach der Optimierung noch suboptimal ist und im schlimmsten Fall ein neuer Assay erforderlich wird.

Der Bereich der tolerierbaren Effizienzwerte soll vom Benutzer vor Beginn des Optimierungsprozesses festgelegt werden. Im Idealfall soll der Wirkungsgrad über 95 % liegen. Es ist jedoch möglich, genaue Messungen mit Assays durchzuführen, die eine Effizienz von < 90 % aufweisen, und wie beim Primerdesign kann durch die Zielsequenz vorgegeben werden, dass das Ziel nicht mit einer höheren Effizienz amplifiziert werden kann. Dennoch ist es wahrscheinlich, dass bei Verwendung eines Assays mit geringerer Effizienz die Präzision und die Nachweisgrenze beeinträchtigt werden. Unter diesen Umständen ist es unerlässlich, bei der Auswertung und Berichterstattung von Daten einen angemessenen Ermessensspielraum zu haben¹.

Optimierung der Sondenkonzentration

Eine Endkonzentration von 250 nM Sonde kann für die meisten Assays verwendet werden. Wenn jedoch keine maximale Empfindlichkeit erforderlich ist, können niedrigere Sondenkonzentrationen ausreichen, wodurch die Assay-Kosten gesenkt werden. Um die Bedingungen für die Sonde zu optimieren, testen Sie diese in verschiedenen Konzentrationen von 50 bis 500 nM in Kombination mit den optimierten Konzentrationen der Primer und der niedrigsten Konzentration der Zielnukleinsäure, die voraussichtlich in den endgültigen Versuchen enthalten sein wird. Es kann die niedrigste Sondenkonzentration verwendet werden, die den empfindlichsten Nachweis ermöglicht (C_q ≤ 30 mit bester Reproduzierbarkeit).

Optimierung von Reaktionskomponenten und Multiplex-Assays

Es gibt einige Assays, die besonders empfindlich auf Puffer/Reaktionsbedingungen reagieren. Bei diesen Assays können weitere Modifikationen der Reaktionspuffer durch Optimierung der MgCl₂-Konzentration, Zugabe von PCR-Verstärker (Mueller in PCR Technologies; Current Innovations, 2013⁵) oder Anpassung der Anstiegsrate des Geräts zu einer verbesserten Leistung führen. Zusätzlich zu den in den vorangegangenen Abschnitten dargelegten Leitlinien für die Assay-Optimierung sind diese Faktoren bei der Optimierung von Multiplex-Reaktionen besonders wichtig.

Optimierung der Mg²⁺-Konzentration

Magnesium spielt in der PCR mehrere Rollen. Es ist ein erforderliches zweiwertiges kationisches Gegenion für dNTP und ein Co-Faktor für alle Polymerasen. Zweiwertige Kationen beeinflussen die DNA-Doppelstranghybridisierung stark. Mit zunehmender Magnesiumkonzentration erhöht sich die Stabilität bzw. die Schmelztemperatur eines DNA-Duplexes. Daraus folgt, dass ein hoher Magnesiumgehalt die Affinität der Primer zur Hybridisierung erhöht, einschließlich Mispriming und Wechselwirkungen zwischen Primern. Die falsch geprimten DNA-Duplexe werden zu Substraten für die DNA-Polymerase, sodass Nebenprodukte entstehen und die PCR-Effizienz sinkt. Daher wirkt sich die MgCl₂-Konzentration sowohl auf die Spezifität als auch auf die Ausbeute der PCR aus, da Magnesium die Hybridisierung des Primers mit dem Ziel, die Prozessivität der Taq-DNA-Polymerase sowie die Hydrolyserate des Exonuklease-Teils bei der Sondenspaltung in der qPCR beeinflusst. Eine unzureichende MgCl₂-Konzentration führt daher zu einer schlechten Ausbeute aufgrund einer niedrigen Polymerisationsrate der DNA-Polymerase, einer beeinträchtigten Primerbindung und einer ineffizienten Sondenspaltung. Ist die MgCl₂-Konzentration zu hoch, wird die Spezifität der Reaktion beeinträchtigt, da dies zu einer größeren Stabilität der unspezifischen Primerhybridisierung führt.

Im Gegensatz zu herkömmlichen PCR-Assays, bei denen 1,5-2 mM Standard-MgCl₂-Konzentrationen verwendet werden, erfordern qPCR-Assays mit Hydrolysesonden höhere Konzentrationen von etwa 3-5 mM, um eine effiziente Spaltung der Sonde zu erreichen. Die Gegenwart von MgCl₂ erhöht auch die DNA-Hybridisierungsrate und ermöglicht eine effiziente Hybridisierung unter den schnellen Zyklusbedingungen, die von vielen Geräten verwendet werden. Die Optimierung der MgCl₂-Konzentration wird bei Multiplex-Reaktionen immer wichtiger.

Salze wie KCl oder (NH₄)₂SO_4, verändern ebenfalls die T_m, des DNA-Duplexes, aber die Auswirkungen sind bei diesen einwertigen Kationen weniger drastisch.

Abbildung 9.5. Auswirkungen der Magnesiumkonzentration.

Die in Abbildung 9.5 dargestellten Auswirkungen werden bei der Durchführung von Multiplex-PCR noch verstärkt. Die gleichzeitige Durchführung mehrerer Reaktionen führt zu einer Konkurrenz der Reagenzien und verschlimmert suboptimale Bedingungen, was zu erheblichen Veränderungen der PCR-Effizienz führt.

Anstiegsraten

In seltenen Fällen kann es vorkommen, dass eine schwierige Reaktion weitere Änderungen erfordert. Wenn alle anderen Möglichkeiten ausgeschöpft sind, kann es möglich sein, einen Vorgang mit minderwertigem Ausgang durch empirische Tests und Änderung der PCR-Anstiegsrate wiederherzustellen.

Auswahl der Sondenfluorophore und Quencher

Bei der Durchführung von Multiplex-Assays ist es auch wichtig, die spektrale Trennung der Mehrfachemissionen von verschiedenen Fluorophoren zu maximieren, um die Signalisolierung und Datenanalyse zu erleichtern. Daher sind Fluorophore mit geringen, gut aufgelösten Bandbreiten, die weit voneinander entfernt sind, für Multiplex-Anwendungen von Vorteil. In der Praxis wird die Wahl des Fluorophors jedoch durch das optische System des Instruments eingeschränkt. Das Kapitel über quantitative PCR und digitale PCR-Nachweismethoden enthält weitere Informationen zur Auswahl von Fluorophoren und Quenchern.

Leitlinien für die Optimierung der PCR (RT-qPCR) mittels quantitativer reverser Transkription

Bei der Durchführung von RT-qPCR ist es, wie zuvor erörtert, nicht nur wichtig, die Richtlinien für die Standard-qPCR zu beachten und die RT zu optimieren, wie unter Reverse Transkription beschrieben, sondern auch die folgenden Punkte zu beachten, die für den RT-Schritt spezifisch sind:

• Überprüfen der RNA-Qualität (Probenaufbereitung und Qualitätsbewertung).
  
• Bestätigen, dass die Primer lange Introns überspannen oder flankieren (Assay-Planung für PCR/qPCR/dPCR).
  
• Optimieren der reversen Transkription (umgekehrte Transkription).
  
• Überprüfen der No-Reverse-Transkriptase- (noRT) Kontrolldaten.

Bestätigen, dass Primer lange Introns überspannen oder flankieren

Während der Großteil der gDNA bei der RNA-Aufreinigung aus der Probe entfernt wird, gibt es kein Verfahren, in dem die gesamte DNA entfernt wird. Da die PCR in der Lage ist, ein einzelnes DNA-Molekül zu amplifizieren, wird bei der RT-qPCR neben der RNA auch kontaminierende DNA amplifiziert. Wenn die Ziel-mRNA relativ häufig vorkommt (Hunderte oder Tausende Kopien pro Zelle), ist das aus der kontaminierenden DNA-Amplifikation resultierende Signal im Vergleich zu den RNA-Produkten vernachlässigbar. Wenn die Ziel-mRNA jedoch mäßig häufig oder selten ist (< 100 Kopien/Zelle), kann das aus der DNA-Amplifikation resultierende Signal irrtümlicherweise zu falschen hohen Schätzungen der mRNA-Mengen führen. Um eine DNA-Amplifikation während der RT-qPCR zu vermeiden, sollen nach Möglichkeit Primer verwendet werden, die entweder ein Intron flankieren, das in der mRNA-Sequenz nicht vorhanden ist, oder die eine Exon-Exon-Grenze überspannen (Assay-Planung für PCR/qPCR/dPCR).

Wenn das Gen von Interesse keine Introns enthält, wenn die Intronpositionen unbekannt sind oder wenn es keine geeigneten Primer gibt, die Introns überspannen oder flankieren, kann es erforderlich sein, die RNA-Eingabe mit einer RNase-freien oder DNase I in Amplifikationsqualität zu verdauen. Die Daten von noRT-Kontrollen können verwendet werden, um festzustellen, ob ein weiterer Verdau mit DNase I erforderlich ist.

Überprüfen der No-Reverse-Transkriptase- (noRT) Kontrolldaten

Unabhängig davon, ob die Primer Introns überspannen oder flankieren, soll die Spezifität von RT-qPCR-Assays in Kontrollreaktionen getestet werden, die keine reverse Transkriptase enthalten (noRT-Kontrolle), um eine mögliche Amplifikation durch kontaminierende DNA zu bewerten. Wie in Assay-Planung für PCR/qPCR/dPCR beschrieben, können DNA-Sequenzen mit kurzen Introns (≤1 kb) erfolgreich in der RT-PCR amplifiziert werden. Viele Gene haben zusätzliche Kopien oder Pseudogene, denen ein oder mehrere Introns fehlen. Daher sollen die DNA-Beiträge zu den Ergebnissen von RT-PCR-Assays getestet werden, indem eine Reaktion, die die RNA-Probe, aber kein RT-Enzym enthält, neben Reaktionen durchgeführt wird, die sowohl RNA als auch RT-Enzym enthalten (Abbildung 9.6). Die DNA-Amplifikation gilt bei der qPCR als akzeptabel, wenn die C_q-Werte für noRT-Reaktionen mindestens 5 Zyklen mehr umfassen, als die für Reaktionen mit RT6. Wenn jedoch weniger als 5 Zyklen zwischen den C_q-Werten für Reaktionen mit und ohne RT liegen, kann die DNA-Amplifikation zur mRNA-Quantifizierung beitragen.

Abbildung 9.6. Bewertung von noRT-Kontrollen. RT-PCR-Produkte, die in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (-) des RT-Enzyms hergestellt wurden, wurden auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel 2 % in TBE fraktioniert. Primer für das mRNA-Ziel in A flankieren ein 1 kb-Intron. Das mRNA-Ziel in B stimmt mit mehreren Genen überein, von denen mindestens eines ein Pseudogen ist, dem das Intron zwischen den für die RT-PCR verwendeten Primern fehlt und das daher mit und ohne RT-Enzym ein Produkt gleicher Größe ergibt.

Wenn die DNA-Kontamination der RNA ein signifikantes Signal zum Experiment beiträgt, soll die RNA vor der RT-qPCR mit einer RNase-freien oder DNase I in Amplifikationsqualität verdaut werden, um eine zuverlässige Quantifizierung der mRNA zu ermöglichen. Beachten Sie, dass der DNase-Verdau auf der Säule (ein Verfahren, das mit vielen handelsüblichen RNA-Aufreinigungskits angeboten wird, bei dem ein DNase-Verdau durchgeführt wird, während die RNA an eine Kieselgelsäule gebunden ist) bei der Beseitigung der DNA weniger wirksam ist als der Verdau in Lösung nach der Elution der RNA von der Säule. Infolgedessen ist der DNase-Verdau auf der Säule (OC) für RT-qPCR möglicherweise nicht ausreichend (Abbildung 9.7). noRT-Kontrollen sollen mit DNase-verdauter RNA durchgeführt werden, um zu überprüfen, ob der Verdau erfolgreich und ausreichend war. In dem in Abbildung 9.7 gezeigten Beispiel reicht der OC-DNase-Verdau aus, um die Ziel-mRNA zuverlässig nachzuweisen. Es würde nicht ausreichen, eine viel weniger häufig vorkommende mRNA zuverlässig zu quantifizieren, wenn eine höhere Empfindlichkeit erforderlich wäre.

Beachten Sie, dass unterschiedliche Zell- und Gewebetypen sowie unterschiedliche Wachstumsbedingungen deutlich unterschiedliche Konzentrationen spezifischer mRNA produzieren. Darüber hinaus ergeben verschiedene RNA-Aufreinigungsmethoden unterschiedliche Mengen an kontaminierender DNA. Daher sollen Reaktionen mit und ohne reverse Transkription mindestens einmal mit jedem neuen Ausgangsmaterial, jeder neuen RNA-Vorbereitungsmethode oder jedem neuen Assay durchgeführt werden.

Abbildung 9.7. Vergleich des DNase-Verdaus auf der Säule (OC) mit dem DNase-Verdau nach der Vorbereitung. Die Gesamt-RNA wurde aus 30-mg-Stücken der Mausleber entweder mit unserem GenElute™ Total RNA-Kit oder mit einem Säulenaufreinigungsverfahren eines anderen Anbieters vorbereitet, jeweils gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zwei RNA-Proben wurden mit dem DNase-Produkt auf der Säule des jeweiligen Herstellers und zwei ohne DNase-Verdau vorbereitet. Nach der Aufreinigung wurden Aliquote der vier RNA-Proben, die ohne DNase auf der Säule vorbereitet wurden, mit unserer DNase I in Amplifikationsqualität gemäß den Anweisungen des Herstellers verdaut. Alle wurden zu gleichen Teilen für die einstufige RT-qPCR verwendet. Abgebildet sind Fluoreszenzkurven zweier RNA-Proben. Mit den Produkten beider Hersteller wurden ähnliche Ergebnisse erzielt und nur bei dem Verfahren, das eine DNase-Behandlung nach der Aufreinigung erfordert, wurde die gesamte gDNA entfernt.

Assay-Auswertung

Sobald der Assay so optimiert wurde, dass die empfindlichsten Bedingungen ermittelt wurden, ist es wichtig, die Spezifität, Effizienz und den technischen Dynamikbereich des Assays zu bestimmen.

Bestimmung der Spezifität durch Schmelzkurvenanalyse

Die Spezifität kann mit Hilfe einer Schmelzkurvenanalyse bestimmt werden. Die Durchführung einer Schmelzkurve erfordert die Einbindung eines Reporterfarbstoffs wie SYBR Green I oder die Verwendung einer nicht hydrolysierenden Sonde wie Molecular Beacon oder einer Scorpions^® Sonde (siehe Quantitative PCR und digitale PCR-Nachweismethoden). Nachdem das Amplikon bei der qPCR hergestellt wurde, wird es einer Inkubation bei steigenden Temperaturen unterzogen, in der Regel zwischen 55 °C und 95 °C. Es ist wichtig, dass der Bediener überprüft, ob der theoretische Schmelzpunkt des Amplikons in diesem Bereich liegt, da dieser von Größe und GC-Gehalt abhängt. Die experimentelle T_m variiert geringfügig zwischen verschiedenen Läufen und Reagenzien, vor allem aufgrund von Schwankungen der MgCl₂ und anderer Ionenkonzentrationen.

Die Fluoreszenzänderung wird bestimmt und als Fluoreszenzänderungsrate in Abhängigkeit von der Temperatur dargestellt. Da SYBR Green I ein unspezifischer Farbstoff ist, der an jede doppelsträngige DNA bindet, ist es wichtig zu überprüfen, ob die qPCR nur das gewünschte Produkt erzeugt, wenn diese Nachweischemie verwendet wird. Mit Hilfe der Schmelz- oder Dissoziationskurvenanalyse lassen sich die Anzahl und die ungefähre Größe der Produkte bestimmen. Ein Assay mit hoher Spezifität führt in Reaktionen, die nur das Ziel enthalten, zu einem einzigen Schmelzpeak bei hoher Temperatur, während in den Negativkontrollen nichts oder nur sehr wenig nachgewiesen wird (Abbildung 9.8A). Wenn die Schmelzkurve mehr als einen Hauptpeak aufweist, wie in den Abbildungen 9.8B und 9.8C, kann die Identität der Produkte weiter untersucht werden, indem sie auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel aufgelöst werden. Wie in den Abbildungen 9.8D und 9.8E dargestellt, enthalten die Reaktionen B und C übermäßige Mengen an Primer-Dimeren oder anderen unspezifischen Produkten. Die Verringerung der Primerkonzentration führt häufig zu einer Verringerung der Menge unspezifischer Produkte. Werden bei niedrigen Primermengen immer noch unspezifische Produkte in signifikanter Menge nachgewiesen, ist es am besten, die Primer neu zu entwerfen.

Abbildung 9.8. Auswertung von Schmelzkurven. Schmelz- oder Dissoziationskurven, die einen steilen Peak des spezifischen Produkts bei > 80 °C und nur sehr wenig unspezifisches Produkt bei niedrigeren Temperaturen (A) oder erhebliche Mengen an unspezifischem, niedriger schmelzendem Produkt (B und C) aufweisen. In D bis F werden PCR-Produkte aus den Schmelzkurven A bis C dargestellt, die auf mit Ethidiumbromid gefärbten 2%-Agarosegelen aufgelöst wurden.

Ein Beispiel für eine Schmelzkurvenanalyse, die eine gDNA- und NTC-Primer-Dimer-Kontamination der RNA zeigt, ist in Abbildung 9.9 dargestellt. In Abbildung 9.9A wird ein spezifisches Produkt aus den Testreaktionen dargestellt und ein kleineres Produkt, das bei niedrigerer Temperatur schmilzt, ist im NTC vorhanden. Dies ist ein Hinweis auf die Bildung von Primer-Dimeren in Abwesenheit des Templates. Dies ist normal und nur dann besorgniserregend, wenn diese Primer-Dimer-Produkte in den Testproben evident sind, wie in Abbildung 9.8 dargestellt. Das Beispiel in Abbildung 9.9B zeigt den Nachweis des unbearbeiteten gDNA-Gens in einer DNA-Probe unter Verwendung des gleichen Assays auf (in diesem Fall befanden sich die Primer in Exons, die das Intron überspannen), der auch für den mRNA-Nachweis verwendet wurde. Die Produkte unterscheiden sich durch ihr Schmelzprofil, wobei das gDNA-Produkt bei einer höheren Temperatur schmilzt, weil es auch das Intron enthält.

Abbildung 9.9. Beispiel für eine Schmelzkurvenanalyse A) Primer-Dimere in einer Negativkontrolle und B) die Amplifikation über das Intron der gDNA.

Bei der Entwicklung von Assays für die Genotypisierung ist die Spezifität von entscheidender Bedeutung. Dabei handelt es sich häufig um Sonden-Assays, bei denen eine einzelne Basendifferenz unterschieden werden muss, z. B. bei der Unterscheidung zwischen Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP). In diesem Fall ist es entscheidend, jede Sonde in einer einzelnen Reaktion gegen ein Template zu testen, von dem bekannt ist, dass es die spezifische übereinstimmende Sequenz enthält, und gegen die nicht übereinstimmende Sequenz.

Bestimmung der Effizienz und der Nachweisgrenze

Die effektivste Methode zur Messung der Assay-Leistung ist die Erstellung einer Standardkurve aus einer seriellen Verdünnung des Templates. Die Assay-Effizienz kann als Faktor des Gradienten der Standardkurve gemessen werden. Es wird ein breiter Bereich von Probenkonzentrationen abgedeckt, um sicherzustellen, dass diese eine Grenzverdünnung erreichen, sodass der technische Dynamikbereich des Assays mit dem gleichen Versuch bestimmt werden kann.

Für diese technischen Bestimmungen der Assay-Leistung ist jedes zweckentsprechende Template-Material geeignet. Die Auswahl eines standardisierten, übertragbaren Referenzmaterials ermöglicht die Validierung zwischen und innerhalb von Laboren. Daher kann diese Phase der Validierung an linearisierten oder eingekerbten Plasmiden (überdrehte DNA lässt sich nicht effizient amplifizieren und führt zu geringer Reproduzierbarkeit), klonierten Fragmenten oder synthetischen Oligos durchgeführt werden. Es ist jedoch zu beachten, dass die Validierung an diesen Zielen ein Maß für die Funktion des Assays ist und die durch die Komplexität einer biologischen Probe bedingte Variabilität nicht berücksichtigt wird.

Die Bestimmung des technischen Dynamikbereichs und der Effizienz eines Assays anhand einer Standardkurve ist in Abbildung 9.10 dargestellt. In diesem Beispiel wurde das Template durch eine 10-fache Serie aus 11 Logs verdünnt, sodass die theoretische Nachweisgrenze bei 3 Kopien (niedrigster C_q) liegt, obwohl die Präzision dieser Messung eindeutig durch die Reproduzierbarkeit bestimmt wird, die bei so hohen Zyklen relativ gering ist.

Abbildung 9.10. Ein Beispiel für hohe Reproduzierbarkeit und einen breiten Nachweisbereich unter Verwendung einer seriellen Verdünnung des linearisierten Plasmids. Für jede Verdünnung wurden acht Replikate durchgeführt und die Amplifikation des Ziels mit dem Farbstoff SYBR Green I nachgewiesen. Die Quantifizierung ist zwischen 3×1010 und 3 Kopien möglich.

Die Assay-Effizienz wird durch Messung des Gradienten einer Standardkurve bestimmt, der aus einer Kurve des Logs der Zielkonzentration gegen den C_q besteht (Abbildung 9.10). Ein Assay mit einer Effizienz von 100 % würde eine Verdopplung bei jedem Zyklus (E=2) und einen Gradienten von -3,323 aufweisen.

     Die Effizienz kann anhand der folgenden Gleichung berechnet werden:

     Effizienz = 10^{(-1/Steigung)} –1. Hinweis: Die Software für viele Geräte gibt die Effizienz in
Prozent an. Dieser Wert ist der Prozentsatz aus E=2; eine Effizienz von 95 % entspricht also E=1,9

     Die Steigung = m wird aus der Standardkurve der Gleichung y=mx+C bestimmt.

     C ist der theoretische Achsenabschnitt auf der y-Achse und stellt ein relatives Maß für die Empfindlichkeit des Assays dar.

Steigungen zwischen -3,1 und -3,6 führen zu Effizienzen zwischen 90 % und 110 % und werden in der Regel akzeptiert, aber es ist wichtig, so nahe an 100 % heranzukommen, wie es der Assay erlaubt. Die in Abbildung 9.11 dargestellten Daten veranschaulichen die normale Schwankungsbreite der Effizienz und Empfindlichkeit einer Reihe verschiedener Assays. Dadurch wird dargestellt, wie wichtig es ist, diese Daten in Publikationen anzugeben^1,6-8.

Abbildung 9.11. Ein Beispiel für die Bestimmung der Effizienz und den Vergleich mehrerer potenzieller Referenzgene. Wie zu erkennen ist, haben diese sehr unterschiedliche Effizienzen und Empfindlichkeiten (Daten von Studenten, die an einem qPCR-Workshop für Fortgeschrittene am EMBL teilgenommen haben).

Es wurden alternative Ansätze für die Berechnung der Effizienz von Standardkurven vorgeschlagen. Mit diesen Methoden wird die Effizienz einzelner Reaktionen im Röhrchen gemessen. Diese Ansätze beruhen auf Algorithmen zur Modellierung der Amplifikationskurven und sind daher von der Anzahl der Zyklen abhängig, über die ein Anstieg der Fluoreszenz zu verzeichnen ist. Dies gelingt am ehesten, wenn die Messung mit einem DNA-bindenden Farbstoff oder mit Scorpions^® Sonden durchgeführt wird, da diese Assays eine größere Fluoreszenzänderung pro Zyklus erzielen. Obwohl diese Ansatzart eine ideale Alternative zu Standardkurven darstellt, ist letztere immer noch die gängigere Methode für die Assaybewertung. Dies liegt daran, dass Standardkurven nicht nur eine Einschätzung der Effizienz ermöglichen, sondern auch zusätzliche Informationen über den dynamischen Arbeitsbereich, die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit liefern und konzeptionell einfacher anzuwenden sind⁹.

Der R²-Wert, d. h. die Übereinstimmung der Daten mit der Geraden der Standardkurve, ist ein Maß für die Reproduzierbarkeit und wird durch die Pipettiergenauigkeit und den dynamischen Bereich des Assays beeinflusst. Daher ist es bei der Bewertung von Assays wichtig, für jede Verdünnung mindestens drei technische Replikate zu verwenden. Wenn R² ≤ 0,985 ist, liefert der Assay möglicherweise keine zuverlässigen Ergebnisse, da die Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten gering ist. Wenn ein oder mehrere Punkte bei den niedrigsten Konzentrationen der eingegebenen Nukleinsäure aus dem linearen Bereich der Kurve verschoben sind, ist es wahrscheinlich, dass die gemessene Konzentration die Empfindlichkeit des Assays überschreitet. Wenn ein oder mehrere Punkte bei der höchsten Kopienzahl der eingegebenen Nukleinsäure aus dem linearen Bereich der Kurve verschoben sind, ist es wahrscheinlich, dass die Reaktion gesättigt ist und dass die Konzentration des Ziels den nützlichen Assaybereich überschreitet. Wenn jedoch mehrere zufällige Punkte über oder unter der Linie liegen, können die Pipettiergenauigkeit oder die Assay-Optimierung ein Problem darstellen. Überprüfen Sie, ob die Spitzen richtig auf die Pipette passen und ob das dosierte Volumen reproduzierbar ist. Überprüfen Sie darüber hinaus die Primeroptimierung wie weiter oben beschrieben.

Die Standardkurve ist ein wichtiges Instrument für die Validierung von Multiplex-Reaktionen. Die gleichzeitige Durchführung mehrerer Reaktionen führt zu einer Konkurrenz der Reagenzien und verschlimmert suboptimale Bedingungen, was zu erheblichen Veränderungen der PCR-Effizienz führt. In Abbildung 9.12 wird dieser Punkt verdeutlicht. Die Effizienzkurven für zwei Primer-/Sonden-Ziele wurden einzeln und dann im Multiplex durchgeführt. Im Diagramm wird dargestellt, dass die Einzelreaktionen (dunkelblaue und grüne Linien) zwar relativ ähnliche Effizienzen und Empfindlichkeiten (Werte auf der y-Achse) ergeben, die gemeinsame Durchführung der Reaktionen jedoch die Empfindlichkeit und den Wirkungsgrad der Multiplexreaktion drastisch verändert.

Abbildung 9.12. Singleplex-Reaktion vs. Duplex-Reaktion.

Literatur

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