Vektor pLKO-1 a návrh shRNA Často kladené otázky

Je pLKO.1 vektor na bázi HIV, a pokud ano, existují nějaké problémy s biologickou bezpečností?

Jak fungují vlastnosti virového systému?

Proč je použit promotor U6?

Jaká restrikční místa byla použita pro klonování sekvencí shRNA? Musím sekvence přenést do jiné páteře vektoru?

Můžu vyhledávat a navrhovat vlastní shRNA na stránce TRC "Search for shRNA hairpin sequences"?

Proč necílový kontrolní vektor neovlivňuje expresi savčích genů?

Mohou být lentivirové částice MISSION^® dále množeny v laboratoři?

Proč je vždy k dispozici klon pro oblast 3' UTR?

Které obalové systémy jsou kompatibilní s pLKO.1. shRNA vektory?

Obsahuje knihovna MISSION^® TRC čárový kód, který bych mohl použít pro analýzu pomocí microarray?

Bílkovina, kterou hodlám knockdownovat, je velmi stabilní, prodlouží se exprese siRNA na dlouhou dobu, kdy se buňky dělí?

Má pLKO.1. obsahuje WPRE?

MISSION^® shRNA Vector Map

Je pLKO.1 vektor na bázi HIV, a pokud ano, existují nějaké problémy s biologickou bezpečností?"

Vektor pLKO.1 je plazmid na bázi lentiviru (HIV). Tento vektor je považován za materiál úrovně biologické bezpečnosti 2 a je bezpečný pro použití díky svým modifikovaným vlastnostem (odstranění řady akcesorních genů, které se podílejí na virulenci HIV, minimální genom virových částic, nereplikující se a samoinaktivační vlastnosti), díky nimž není schopen produkovat virus po infikování do hostitelské buňky. Konkrétní požadavky konzultujte s pracovníkem pro biologickou bezpečnost vaší instituce.

Mohou být lentivirové částice MISSION^® dále množeny v laboratoři?

Ne, virové částice nelze z důvodů biologické bezpečnosti množit. Lentivirové částice MISSION^® TRC jsou replikačně nekompetentní. Částice jsou vyrobeny s využitím vlastností 2^druhé a 3^druhé generace lentivirálních obalových systémů. Geny pro replikaci a strukturní proteiny v zabaleném virovém genomu chybí, protože tyto geny dodávají jiné plazmidy v balicích buňkách. Virový genom obsahuje pouze oblast mezi 5' a 3' LTR pLKO.1. Kromě toho lentivirový vektor obsahuje samoaktivující se 3' LTR, která mu znemožňuje produkovat infekční virus, jakmile se integruje do hostitelského chromozomu.

Jak fungují funkce virového systému?

Knihovna je založena na lentivirovém systému. To umožňuje produkci virových částic ve vhodné obalové buněčné linii. Po infekci výslednými lentivirovými částicemi je sekvence shRNA integrována do chromozomu pro stabilní expresi vlásenkové RNA. Obal VSV-G je pantropický a umožňuje přenos prakticky do jakékoli buňky. Navíc lentivirus nevyžaduje mitotickou událost pro integraci do genomu hostitelské buňky.

Proč je vždy klon pro oblast 3' UTR?

Klony, které jsou proti 3' UTR cílového genu, jsou zařazeny proto, aby bylo možné zachránit fenotyp knockdownu zavedením klonu cDNA odpovídajícího cíli. Transkripty z exogenního klonu cDNA by nebyly náchylné k umlčení ve srovnání s endogenní kopií. Mnoho publikací/recenzních komisí vyžaduje takový experiment k ověření pozorovaného fenotypu. Nicméně zatímco většina genových sad má tuto přidanou funkci, ne všechny mají klon 3' UTR.

Proč se používá promotor U6?

Pro řízení exprese vlásenky shRNA se používá lidský promotor U6 (promotor pol III). Exprese pomocí promotorů pol III je optimální pro výrobu shRNA díky přesné iniciaci a terminaci transkripce. Společnost TRC zvolila U6 na základě experimentálních údajů, které ukazují vynikající účinnost ve srovnání s jiným účinným promotorem pol III (H1).

Které obalové systémy jsou kompatibilní s pLKO.1 shRNA?

MISSION^® TRC shRNA jsou klonovány do pLKO.1. přenosového vektoru, který je kompatibilní se standardními 2 plazmidovými (obalový vektor s genem rev a obálkovým vektorem) nebo 3 plazmidovými (obalový vektor bez genu rev, obálkový vektor a expresní vektor rev) obalovými systémy.

Jaká restrikční místa byla použita pro klonování sekvencí shRNA? Zajímá mě to, protože bych chtěl získat nějaké konstrukty shRNA, ale musel bych sekvence přenést do jiné páteře vektoru?

Sekvence shRNA byla klonována do míst AgeI a EcoRI. Jednotlivé sekvence vlásenek najdete také na našich webových stránkách.

Obsahuje knihovna MISSION^® TRC čárový kód, který bych mohl použít pro analýzu pomocí microarray?

V současné době naše vektory neobsahují vnitřní čárový kód ani nesdružují klony pro genovou sadu. Jednotlivé sekvence shRNA můžete použít ke screeningu výsledných populací klonů pro stabilní integraci.

Můžu na stránce TRC "Search for shRNA hairpin sequences page" vyhledávat a navrhovat vlastní shRNA?

Algoritmus používaný k návrhu knihovny klonů MISSION^® TRC je obecně stejný jako ten, který najdete na stránce TRC. V průběhu klonování knihovny Broad-TRC však došlo k řadě vylepšení návrhu. Klony, které najdete na veřejné stránce TRC, nejsou nejaktuálnější verzí návrhu. Aktualizované klony TRC jsou k dispozici pouze členům TRC a prostřednictvím nákupu u společnosti Sigma-Aldrich.

Bílkovina, kterou hodlám vyřadit, je velmi stabilní, prodlouží se exprese siRNA na delší dobu, kdy se buňky dělí?

Jelikož je knihovna založena na lentivirech, umožňuje stabilní integraci shRNA do hostitelského chromozomu. Stabilní klony nebo populace lze selektovat přidáním puromycinu. Jednotlivé klony lze vybírat a rozšiřovat. Vzhledem k náhodné integraci shRNA umožňuje screening několika klonů optimální knockdown vašeho zájmového genu a ověření možných vzorců exprese mimo cíl.

Proč necílový kontrolní vektor neovlivňuje expresi mamilárního genu?

Necílový kontrolní vektor (SHC002, .SHC002V) obsahuje insert shRNA, který není cílený na lidské a myší geny, takže je užitečný jako negativní kontrola při experimentech využívajících klony knihovny MISSION® shRNA. Sekvenci vlásenky a mapu vektoru naleznete v výpisu produktů seznamu.

Podporuje pLKO.1 obsahuje WPRE?

Ne, WPRE (Woodchuck Response Element) je známý svou schopností zvyšovat transrypci transgenů. Nepředpokládá se však, že je nezbytný pro transkripci shRNA. Kromě toho někteří naznačují, že WPRE může hrát roli v aktivitě onkogenů a může mít důsledky in vivo a v klinických studiích.