ChIP-X: Zesíťování proteinů s DNA a buněčná lýza

Zesíťování stabilizuje spojení cílového proteinu s interagujícími sekvencemi DNA. V některých případech jsou cílové proteiny již pevně spojeny s DNA a k zachování komplexu protein/DNA během experimentální analýzy není zapotřebí dalších chemických křížových vazeb. Tento postup se nazývá nativní ChIP nebo N-ChIP. N-ChIP je vhodný pro cílové látky, jako jsou histony a modifikace histonů. Je však důležité si uvědomit, že bez dodatečného zesíťování může během vaší analýzy stále docházet k modifikacím in vivo v nukleozomech. Při cílení na proteiny, které se slabě vážou na DNA, důrazně doporučujeme použít protokol ChIP se síťováním (X-ChIP). X-ChIP lze provádět pomocí UV světla, formaldehydu nebo jiných chemických síťovacích látek.

Pro přípravu vzorků in vivo se obvykle upřednostňuje formaldehydové síťování, protože tato modifikace je reverzibilní a umožní vám izolovat a amplifikovat DNA obohacenou o ChIP. Navíc je síťovací vzdálenost formaldehydu pouze 2 Å (0,2 nm), což zajišťuje, že síťujete proteiny, které jsou již úzce spojeny s DNA. Formaldehyd také vytvoří příčné vazby mezi proteiny vážícími DNA a proteiny s nimi spojenými, což usnadní studium nepřímých interakcí proteinů s DNA. Formaldehydové síťování je schopno odolat následným experimentálním manipulacím, což umožňuje izolovat neporušené komplexy proteinů a DNA. Formaldehyd však může někdy způsobit nespecifické síťování.

Buněčná lýza usnadňuje uvolnění buněčných jader a eliminuje složky cytoplazmy, které mohou přispívat k signálům na pozadí. Úspěch vaší analýzy ChIP bude záviset na účinnosti postupu lýzy a konečném obnovení chromatinu. Některé protokoly ChIP specifikují použití lyzačních pufrů s vysokými koncentracemi dodecylsulfátu sodného (SDS), které umožňují lýzu celých buněk, zatímco jiné specifikují použití pufrů pro izolaci jader. Lýzy se dosáhne inkubací v příslušných koncentracích pufrů na bázi detergentů a koktejlu inhibitorů proteáz. Doporučuje se také použít mechanickou sílu pomocí homogenizátoru, miniaturního šlehače, vortexeru nebo skleněných kuliček. Zvolená metoda závisí na typu zpracovávaných buněk nebo tkání. Pokud je pro vás lýza buněk obzvláště náročná, může být užitečné prohlédnout si vzorek před a po lýze pod mikroskopem s fázovým kontrastem. To vám umožní zjistit, zda se z buněk uvolnila jádra, nebo pokud používáte celobuněčný lyzační pufr, zda byly narušeny celé buněčné a jaderné membrány.

Tipy pro síťování

1. Standardní podmínky pro síťování formaldehydem jsou 1% formaldehyd při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Dobu síťování lze prodloužit až na 20 minut, aby se usnadnila izolace slabších nebo nepřímých interakcí protein:protein nebo protein:DNA.
2. Používejte pouze formaldehyd molekulárně-biologické kvality: formaldehyd je stabilizován metanolem a po odpaření metanolu může formaldehyd vytvořit bílou sraženinu. Nepoužívejte formaldehyd, který tuto sraženinu obsahuje.
3. Dlouhá doba síťování může maskovat epitopy cílového proteinu a snížit vazebnou účinnost vaší protilátky ChIP.
4. Neadekvátní síťování může mít za následek ztrátu vašich komplexů protein/DNA během dalších kroků protokolu.
5. Může být třeba zvážit stav buněk nebo tkáně během ošetření síťovacími činidly (tj. v přítomnosti kultivačního média versus fosfátového pufrovaného roztoku). Kultivační médium obsahuje molekuly, které mohou reagovat s formaldehydem a potenciálně vyčerpat molekuly formaldehydu a snížit očekávanou účinnost síťování.

Další informace o průvodcích experimenty ChIP, tipy pro řešení problémů a doplňkové protokoly naleznete v našem Stránka Chromatin Immunoprecipitation (ChIP).