Postup stanovení trypsinu (EC 3.4.21.4)

Přečtěte si více informací

• Precautions
• Potřebné reagencie a vybavení
• Pokyny k přípravě
• Postup
• Výsledky
• Související produkty
• Reference

Tento postup je určen ke stanovení aktivity trypsinu za použití N_α-benzoyl-L-arginin ethyl esteru (BAEE) jako substrátu. Postup je kontinuální spektrofotometrické stanovení rychlosti (A₂₅₃, světelná dráha = 1 cm) založené na následující reakci:

BAEE + H2O+ Trypsin

→

Nα-Benzoyl-L-arginin + ethanol

kde:
BAEE = N_α-Benzoyl-L-arginin ethyl ester

Definice jednotky - Jedna jednotka aktivity BAEE trypsinu vytvoří ΔA₂₅₃ 0.001 za minutu s BAEE jako substrátem při pH 7,6 při teplotě 25 °C v reakčním objemu 3,20 ml.

Precautions

Informace o nebezpečnosti a bezpečném zacházení naleznete v bezpečnostním listu.

Potřebné reagencie a vybavení

Fosforečnan sodný, monobazický  (katalogové číslo: S0751), který se používá k přípravě přípravku. S0751)

N_α-benzoyl-L-arginin ethyl ester (BAEE, katalogové č. B4500)

1 M NaOH solution

1 M Hydrochloric acid (Catalog No. 318949)

Pokyny pro přípravu

Pro přípravu činidel použijte ultračistou vodu (≥18 MΩxcm odporu při 25 °C).

Pufr (67 mM fosforečnanový pufr sodný, pH 7,6 při 25 °C) - Připravte si 8.04 mg/ml roztoku pomocí fosforečnanu sodného, monobazického  (katalogové číslo  S0751) v ultračisté vodě. Upravte na pH 7,6 při teplotě 25 °C roztokem 1 M NaOH.

Substrátový roztok (0.25 mM N_α-benzoyl-L-arginin ethylester) - Připravte si 0.086 mg/ml roztoku s použitím N_α-benzoyl-L-arginin ethylesteru  (BAEE, katalogové č. 1), který se připraví z N_α-benzoyl-L-arginin ethylesteru . B4500) v pufru.

RoztokHCl (1 mM kyselina chlorovodíková) - Připravte si tisícinásobné ředění 1 M roztoku kyseliny chlorovodíkové  (katalogové č. B&B&B&B), který se používá k přípravě roztoku kyseliny chlorovodíkové. 318949) v ultračisté vodě.

Roztok enzymu (trypsinu) - Bezprostředně před použitím připravte roztok obsahující 425-575 jednotek/ml trypsinu ve studeném (2-8 °C) roztoku HCl.

Postup

V reakční směsi o objemu 3,20 ml jsou konečné koncentrace 62 jednotek.8 mM fosforečnan sodný, 0,23 mM N_α-benzoyl- L-arginin ethylester, 0,031-0.063 mM kyseliny chlorovodíkové, 42,5-115,0 jednotek trypsinu.

1. Do vhodných křemenných kyvet odpipetujte následující činidla:

Reagencie	Prázdný (ml)	Test (ml)
Substrátový roztok	3.00	3,00
Roztok HCl	0,200	0,125

Poznámka: Zkoušku provádějte ve třech opakováních.

2. Smíchejte inverzí a pomocí vhodně termostatovaného spektrofotometru vyrovnejte teplotu na 25 °C. Poté přidejte:

Reagent	Prázdný (ml)	Test (ml)
Roztok enzymu	-	0.075

Poznámka: Konečný objem v každé kyvetě musí být 3,2 ml na jednotku definice.

3. Ihned promíchejte obrácením a zaznamenejte nárůst A₂₅₃ po dobu 5 minut. Pomocí časového úseku 1 minuty a minimálně 4 datových bodů získejte ΔA₂₅₃/minutu s použitím maximální lineární rychlosti pro slepou i testovanou směs.

Výsledky

Výpočty

1.

kde:
df = ředicí faktor
0,001 = Změna A₂₅₃/min na základě definice jednotky
0.075 = objem (ml) testovaného vzorku použitého v testu
Poznámka: Celkový objem v kyvetě se při výpočtu nepoužívá, protože definice jednotky vychází z 3,2 ml.

2.

Jednotky/mg v pevném stavu =	Jednotky/ml enzymu
	mg pevné látky/mL enzymu

Odkazy

1. Bergmeyer H. 1974. Methods of Enzymatic Analysis. 2. New York: Academic Press, Inc..