Postup stanovení proteázy

Princip

Vzhled peptidů se měří jako tyrosinový ekvivalent při 275 nm pomocí spektrofotometrie.

Definice jednotky

Jedna jednotka způsobí zvýšení optické hustoty při 275 nm odpovídající jednomu mikromolu tyrosinu za minutu za níže popsaných podmínek.

Metoda

Reagencie

A. Roztok kaseinu (0,6 % )	：Suspendujte 3,0 g kaseinu z mléka Hammersten ve 20 ml až 0,1 N roztoku NaOH a rozpusťte zahřátím ve vodní lázni (60 ℃). Ochlaďte na pokojovou teplotu, přidejte 50 ml 0,1 M boraxu a 400 ml H2O a po úpravě pH na 11,0 pomocí 1.0 N roztokem NaOH, doplňte do 500 ml H2O］ (Stabilní po dobu jednoho týdne skladovaného při teplotě 0-5 ℃)
B. Směs TCA	：0,11 M kyselina trichloroctová (TCA) obsahující 0,22 M octan sodný a 0,33 M kyselina octová
C. Ředidlo enzymu	：2,0 mM octanu vápenatého

Postup

1. Pipetujte 3,0 ml roztoku substrátu (A) do zkumavky a nechte 5 minut ekvilibrovat při 30 ℃.

Borax		8.6 mM
Kasein	5.1 mg/ml
Ca(CH3COO)2	0.29 mM

2. Přidejte 0,5 ml roztoku enzymu* a promíchejte.
   
3. Přesně po 10 minutách při 30 ℃ přidejte 3,2 ml směsi TCA (B), abyste reakci zastavili.
   
4. Inkubujte dalších 20 minut při 30 ℃.
   
5. Filtrujte směs pomocí filtračního papíru (Toyo Roshi č. 131).) a změřte optickou hustotu filtrátu při vlnové délce 275 nm (OD testu).
   

Současně připravte slepý pokus tak, že po 10minutové inkubaci při 30 ℃ nejprve smícháte roztok substrátu s 3,2 ml směsi TCA (B), poté přidáte roztok enzymu a provedete stejný postup (postup 4-5) při testu (OD slepého pokusu).

* Rozpusťte enzymový přípravek v ledově chladném 10 mM borax-NaOH pufru, pH 11,0 a zřeďte na 0,1-0.4U/ml enzymovým ředidlem (C) bezprostředně před testem.

Výpočet

Aktivitu lze vypočítat podle následujícího vzorce：

Hmotnostní aktivita (U/mg)＝(U/mL)×1/C

Vt	：Celkový objem (6.7 ml)
Vs	：Objem vzorku (0.5 ml)
1,34	：Millimolární extinkční koeficient tyrosinu (F/mikromol)
1.0	：Délka dráhy světla (cm)
t	：Doba reakce (10 minut)
df	：Redicí faktor
C	：Koncentrace enzymu v roztoku (c mg/ml)

Tento postup má informativní charakter.