Enzymatický test jablečné dehydrogenázy

Popis

Tento postup lze použít pro všechny produkty dehydrogenázy kyseliny jablečné.

Kontinuální spektrofotometrické stanovení rychlosti (A₃₄₀, dráha světla = 1 cm) je založeno na následující reakci:

β-NADH - β-nikotinamidadenindinukleotid, redukovaná forma

β-NAD⁺ - β-Nikotinamidadenindinukleotid, oxidovaná forma

MDH - jablečná dehydrogenáza

Definice jednotky - Jedna jednotka jablečné dehydrogenázy přemění 1.0 µmol oxaloacetátu a β-NADH na L-malát a β-NAD⁺ za minutu při pH 7,5 a 25 °C.

Potřebná činidla a vybavení

Fosforečnan draselný, monobazický (P5379)

β-nikotinamidadenindinukleotid, redukovaná, disodná sůl, hydrát (N8129)

Kyselina oxaloctová (O4126)

Kuvety a termostatovaný spektrofotometr

Preventivní opatření

Informace o nebezpečnosti a bezpečném zacházení naleznete v bezpečnostním listu.

Pokyny pro přípravu (skladování/stabilita)

Pro přípravu činidel používejte ultračistou vodu (odpor ≥18 MΩcm při 25 °C).

Fosfátový pufr (100 mM pufr fosforečnanu draselného, pH 7,5 při 25 °C) - Připravte 13,6 mg/ml roztok v ultračisté vodě s použitím fosforečnanu draselného, monobazického (P5379). Upravte na pH 7,5 při 25 °C pomocí 1,0 M KOH.

Roztok β-NADH (0,14 mM roztok β-nikotinamidadenindinukleotidu) - Připravte 0,5 mM roztok β-NADH (0,14 mM roztok β-nikotinamidadenindinukleotidu).11 mg/ml roztoku ve fosfátovém pufru za použití β-nikotinamidadenindinukleotidu, redukovaného, disodná sůl, hydrát (N8129). Připravte čerstvý.

Poznámka: Koncentrace β-NADH se vypočítá pomocí molekulové hmotnosti 781. Tato molekulová hmotnost je korigována na přibližný obsah vody.

Roztok OAA (7,6 mM kyselina šťavelová) - Bezprostředně před použitím připravte 1,0 mg/ml roztok fosfátového pufru s použitím kyseliny šťavelové (O4126). Produkt není stabilní, jakmile je v roztoku. Připravte čerstvý pro každý kinetický běh.

Roztok MDH (jablečná dehydrogenáza) - Bezprostředně před použitím připravte 0,2-0,5 jednotky/ml roztoku ve studeném fosfátovém pufru. Připravte čerstvý.

Postup

Konečné koncentrace testu - V 3,00 ml reakční směsi jsou konečné koncentrace 100 mM fosforečnanu draselného, 0.13 mM β-nikotinamidadenindinukleotidu, 0,25 mM kyseliny šťavelové a 0,02-0,05 jednotky jablečné dehydrogenázy. 

1. Do vhodných kyvet odpipetujte následující činidlo:

Reagencie	Objem (ml)
	Prázdný	Test 1	Test 2	Test 3
Roztokβ-NADH	2.8	2,8	2,8	2,8

2. Vyrovnejte teplotu na 25 °C pomocí vhodně termostatovaného spektrofotometru.

3. Poté přidejte:

Reagencie	Objem (ml)
	Prázdný	Test 1	Test 2	Test 3
Roztok OAA	0.1	0,1	0,1	0.1
Fosfátový pufr	0.1	-	-	-
Roztok MDH	-	0.1	0,1	0,1

4. Ihned promíchejte inverzí a zaznamenejte pokles A₃₄₀ při 25 °C po dobu ~5 minut. S použitím časového úseku 1 minuty a
   minimálně 4 datových bodů získejte hodnotu A₃₄₀/minutu s použitím maximální lineární rychlosti pro slepou i testovanou směs.

Výsledky

Výpočty

1. ΔA₃₄₀/minutu = A₃₄₀/minutu (Test) - A₃₄₀/minutu (Blank)

2.
       

    Kde:

   3.0 = celkový objem (v mililitrech) testu

    df = faktor ředění

    6. Objem (v mililitrech) testu.22 = milimolární extinkční koeficient β-NADH při 340 nm

    V_E = objem (v mililitrech) použitého enzymu

3.    
   

Odkaz

1. Bergmeyer H. 1974. Methods of Enzymatic Analysis. Volume 1, 2nd ed. 485-486.. New York,: Academic Press, Inc..