Enzymatický test peroxidázy (EC 1.11.1.7)

Popis

Tento postup slouží ke stanovení enzymatické aktivity peroxidázy za použití pyrogallolu jako substrátu. Mezi produkty používající tuto metodu patří mimo jiné, P1709, P2088, P6140, P6782, P8125, P8170, P8250, P8375, P8415, a P8651.

Kontinuální spektrofotometrické stanovení rychlosti (A₄₂₀, dráha světla = 1 cm) je založeno na následující reakci:

Definice jednotky: Jedna jednotka peroxidázy vytvoří z pyrogallinu 1,0 miligramu purpurogalinu za 20 sekund při pH 6,0 a 20 °C. Tato jednotka odpovídá ~18 µM jednotkám za minutu při 25 °C.

Preventivní opatření

Informace o nebezpečnosti a bezpečném zacházení naleznete v bezpečnostním listu.

Potřebná činidla a vybavení

1. Vhodné pro použití v praxi.0 M monobazický roztok fosforečnanu draselného (Katalogové číslo P8709)

1.0 M roztok fosforečnanu draselného dibazického (Katalogové číslo P8584)

Peroxid vodíku, 30% (w/w) roztok (Katalogové číslo H1009)

Pyrogallol (Katalogové číslo 254002)

Kuvety a termostatovaný spektrofotometr

Pokyny pro přípravu (skladování/stabilita)

Pro přípravu činidel použijte ultračistou vodu (odpor ≥18 MΩ×cm při 25 °C).

Fosfátový pufr (100 mM fosforečnanový pufr draselný, pH 6,0 při 20 °C) - Přidejte 17,36 ml 1.0 M monobazický roztok fosforečnanu draselného  (katalogové číslo P8709). Přidejte 2,64 ml 1,0 M roztoku dibazického fosforečnanu draselného (katalogové číslo P8584) a upravte na konečný objem 200 ml pomocí ultračisté vody. Upravte na pH 6,0 při 20 °C pomocí 1 N KOH nebo 1 N HCl. Fosfátový pufr uchovávejte na ledu.

Roztok peroxidu (0.50% [w/w] roztok peroxidu vodíku [H₂O₂]) - Připravte si roztok o koncentraci 1:60 pomocí Roztoku peroxidu vodíku, 30% (w/w)  (katalogové číslo H1009) v ultračisté vodě.

Poznámka: Připravte si čerstvé ředění pro kontrolu a vzorek a roztok uchovávejte v uzavřené lahvičce o objemu 4 dcl na ledu, abyste omezili působení vzduchu.

Roztok pyrogallolu (5% [w/v] roztok pyrogallolu) - Připravte 50 mg/ml roztok pomocí .Pyrogallol (katalogové číslo 254002) v ultračisté vodě v jantarové lahvičce (nebo zakryjte fólií).

Poznámka: Připravte si čerstvý roztok a uchovávejte jej na ledu chráněný před světlem.

Roztok peroxidázy - Připravte si 10 mg/ml roztok peroxidázy ve studeném fosfátovém pufru. Bezprostředně před použitím připravte pracovní roztok obsahující 0,45-0,75 jednotky/ml peroxidázy ve STUDENÉM fosfátovém pufru.

Poznámka: Pro stanovení faktoru RZ lze použít zásobní roztok o koncentraci 10 mg/ml.

Postup

Koncentrace pro konečný rozbor - Ve 3. roztoku se provede rozbor s použitím roztoku o koncentraci 0,5 %.00 ml reakční směsi jsou konečné koncentrace 14 mM fosforečnan draselný, 0,027 % (v/v) peroxid vodíku, 0,5 % (w/v) pyrogallol a 0,45-0,75 jednotky peroxidázy.

Poznámka: Provádějte postupně po jedné kyvetě, protože maximální rychlost je v první minutě.

1. Do vhodných kyvet odpipetujte následující činidla:

Reagent	Prázdný (ml)	Test 1 (ml)	Test 2 (mL)	Test 3	Test 2 (mL)br> (ml)
Čistá voda	2.1	2.1	2.1	2.1
Fosfátový pufr	0,32	0,32	0.32	0,32
Roztok peroxidu	0,16	0.16	0,16	0,16
Roztok pyrogallolu	0.32	0,32	0,32	0,32

2. Promíchejte inverzí a ve vhodně termostatovaném spektrofotometru se po dobu ~10 minut vyrovnejte na 20 °C.

Poznámka: Všechny kyvety lze inkubovat současně, ale odečítat lze vždy pouze jednu kyvetu.

3. Poté přidejte:

Reagent	Prázdný (ml)	Test 1 (ml)	Test 2 (mL)	Test 3	Test 2 (mL)br> (ml)
Fosfátový pufr	0.1	-	-	-	-	-
Peroxidázový pracovní roztok	-	0.1	0,1	0,1

4. Ihned promíchejte inverzí a zaznamenávejte nárůst A₄₂₀ po dobu 3 minut. Získejte DA₄₂₀/20 sekund s použitím maximální lineární rychlosti nebo 0,5minutového intervalu pro všechny Testy a Slepou směs.

Kritéria použitelnosti: Rychlost DA₄₂₀/20 sekund musí být v rozmezí 0,18-0,34. Koncentrace enzymu může být v případě potřeby upravena.

Výsledky

Výpočty

1.

Kde:
3 = objem (v mililitrech) testu
df = faktor ředění
12.0 = Extinkční koeficient 1 mg/ml purpurogalinu při 420 nm (stanoveno interně)
0,1 = Objem (v mililitrech) použitého enzymu

2.    

3.

Odkazy

1. Chance B, Maehly A. 1955. Methods in Enzymology. 2, 773-775. Elsevier.

2. Shannon L, Kay E, Lew J. 1966. Peroxidase isozymes from horseradish roots. I. Isolation and physical properties.. The Journal of Biological Chemistry.. 241(9):2166-2172..

04/17-1