Imunoprecipitační souprava (Protein G) Protokol a řešení problémů

 

IMUNOPRECIPITACE S POUŽITÍM IMMOBILIZOVANÉHO PROTEINU G

Imunoprecipitace se používá k analýze cílových antigenů v komplexní směsi proteinů. Zájmový protein lze v jednom kroku koncentrovat a přečistit v analytickém měřítku prostřednictvím specifické protilátky. Imunoprecipitované proteiny jsou často funkčně aktivní a lze je dále analyzovat na enzymatickou aktivitu, interakce, modifikace a strukturu.

Sada (č. produktu 11719386001) obsahuje všechna činidla potřebná pro buněčnou lýzu, solubilizaci, stabilizaci a imunopurifikaci proteinů.

Buněčná lýza a příprava vzorků

1. Buňky/tkáň promyjte alespoň dvakrát ledově studeným PBS, abyste z kultivačního média odstranili všechny zbývající sérové proteiny. Pro jednu imunoprecipitační reakci se doporučuje objem vzorku 1 až 3 ml. Při použití mikrocentrifugy je optimální objem 1 ml.

• Adherentní buňky by měly být promyty přidáním PBS do monovrstvy a likvidací supernatantu. K vychlazené, promyté monovrstvě buněk přidejte lyzační pufr zchlazený na +2 až +8 °C, abyste dosáhli koncentrace 10⁶ až 10⁷ buněk/ml. Pomocí vhodného zařízení seškrábněte buňky na jednu stranu misky.
• Buňky v suspenzi by měly být promyty PBS odstředěním a resuspendováním pelet. Po posledním promytí odstraňte supernatant. Resuspendujte buněčnou peletu v lyzačním pufru ochlazeném na +2 až 8 °C, abyste dosáhli koncentrace 10⁶ až 10⁷ buněk/ml, a přeneste ji do vhodného homogenizačního zařízení.
• Solidní tkáň by měla být promyta přidáním PBS a odstraněním supernatantu. Přidejte ke vzorku lyzační pufr, abyste dosáhli koncentrace 5 až 20 mg tkáně/ml.

2. Přeneste vzorek do homogenizátoru Dounce, předem chlazeného na ledu nebo do jiného typu mikrohomogenizátoru. Uvědomte si, že postup homogenizace může být kritický pro funkční integritu cílového antigenu. Pomocí pěchovadla typu B homogenizujte opakovanými tahy (přibližně 10).

3. Homogenizovanou suspenzi odstřeďte při 12 000 × g, 10 minut, +2 až +8 °C ve stolní mikrostředivce, abyste odstranili zbytky. Případně pro přípravu vysokorychlostního supernatantu odstřeďte při 100 000 × g, 45 minut, +2 až +8 °C.

4. Oddělte supernatant a přeneste jej do mikrozkumavky (optimální objem 1 ml).

Předčištění pomocí Protein G Agarose

Pro snížení pozadí způsobeného nespecifickou adsorpcí irelevantních buněčných proteinů na Protein G Agarose se doporučuje provést krok předčištění.

5. Přidejte 50 μl homogenní suspenze Protein G Agarose (objem lůžka 25 μl) k 1 až 3 ml vzorku a inkubujte při teplotě +2 až +8 °C po dobu nejméně 3 hodin nebo přes noc na houpací plošině.

6. Granule peletujte gravitační sedimentací nebo centrifugací při 12 000 × g po dobu 20 sekund v mikrotransferometru. Přeneste supernatanty do čerstvých zkumavek.

Imunoprecipitace cílového proteinu

7. Přidejte odpovídající množství specifické protilátky a jemně kmitejte při +2 až +8 °C po dobu jedné hodiny.

8. Přidejte do směsi 50 μl homogenní suspenze Protein G Agarose a inkubujte při +2 až +8 °C po dobu nejméně tří hodin nebo přes noc na kývající se plošině.

9. Komplexy se shromáždí gravitační sedimentací nebo odstředěním při 12 000 × g po dobu 20 sekund v mikrotrubičce.


10. Komplexy se shromáždí gravitační sedimentací nebo odstředěním při 12 000 × g po dobu 20 sekund v mikrotrubičce. Opatrně odstraňte supernatant, přidejte 1 ml promývacího pufru 1, resuspendujte kuličky a inkubujte 20 minut při teplotě +2 až +8 °C na houpací plošině.

11. Opakujte kroky 9 a 10.

12. Shromážděte komplexy, jak je popsáno v kroku 9, odstraňte supernatant, resuspendujte pelety v 1 ml promývacího pufru 2, inkubujte při teplotě +2 až +8 °C po dobu 20 minut na kývací plošině, znovu peletujte kuličky a odstraňte supernatant.

13. Zopakujte krok 12.

14. K peletě přidejte 1 ml promývacího pufru 3, resuspendujte, inkubujte při teplotě +2 až +8 °C po dobu 20 minut na kývací plošině, opět peletujte kuličky a odstraňte supernatant.

15. Odstraňte poslední zbytky závěrečného promývacího roztoku z pelety agarózy a ze stěn a víčka mikrofugovací zkumavky.

Gelová elektroforéza

Imunoprecipitované proteiny lze separovat jakýmkoli typem jednorozměrného nebo dvourozměrného elektroforézního systému poskytujícího dostatečné rozlišení proteinů. Podrobný protokol pro SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforézu nebo dvourozměrnou elektroforézu naleznete v některé ze standardních učebnic nebo v příručkách výrobců elektroforézních zařízení.

1. Přidejte k imunoprecipitátu 25 až 75 μl pufru pro nakládání do gelu.
2. Denaturujte proteiny zahříváním na +100 °C po dobu 3 minut. Odstraňte protein G agarózu odstředěním při 12 000 × g po dobu 20 sekund při teplotě +15 až +25 °C v mikrotéce. Přeneste supernatant do čerstvé zkumavky.
3. Alikvotní část analyzujte pomocí elektroforézy v SDS-polyakrylamidovém gelu.

Western Blotting

Po elektroforéze přeneste gel na nitrocelulózovou nebo PVDF membránu pomocí standardního protokolu Western blot. Aby nedošlo k poškození nebo kontaminaci membrány, používejte při manipulaci vždy rukavice.

1. Hydrofobní membrány, jako je PVDF, je třeba na několik sekund navlhčit metanolem a nejméně 5 minut máčet v přenosovém pufru. Nitrocelulózu je třeba krátce namočit ve vodě a poté alespoň 5 minut v přenosovém pufru.
2. Před přenosem je nutné gel důkladně vyrovnat v přenosovém pufru po dobu 5 až 10 minut.
3. Blotujte podle standardních protokolů.
4. Blot lze v případě potřeby skladovat několik měsíců v suchu v chladničce, ale před zahájením imunodetekce je třeba jej znovu navlhčit. PVDF membrány by měly být znovu navlhčeny v methanolu nebo v 5% roztoku Tween 20 (v/v).

Odstraňování problémů

Není signál

Příprava vzorku imunoprecipitací

• Pro snížení rizika degradace antigenu během přípravy vzorku zařaďte další specifické inhibitory proteáz.
• Zvyšte koncentraci primární protilátky až na 5 μg/ml.
• Pro protilátky s nízkou afinitou použijte promývací pufry s nižší striktností (např, 150 mM NaCl, bez detergentu)
• Zkontrolujte afinitu primární protilátky k Protein G Agarose. Pokud se ukáže, že afinita primární protilátky je nízká, změňte ji na vhodnou matrici.

Detekce

• Zkontrolujte, zda byl protein během blotování správně přenesen na membránu.--.>Pokud přenos nebyl účinný, zejména u vysokomolekulárních proteinů, změňte podmínky přenosu (prodlužte dobu přenosu, zvyšte proud nebo přejděte na alternativní přenosové pufry.
• Chybí vysokomolekulární pásy-->prodlužte dobu blotování nebo změňte přenosový pufr.
• Zkontrolujte enzymovou aktivitu konjugátu sekundární protilátky. Na blotovací membránu naneste různé ředění konjugátu s enzymem a přímo detekujte. Pokud se neobjeví žádný signál, použijte čerstvý konjugát enzymu a testujte stejným způsobem. Pokud se stále neobjeví žádný signál, zkontrolujte detekční činidlo.

Slabé signály

Příprava vzorku a imunoprecipitace

• Pro snížení rizika degradace antigenu během přípravy vzorku zařaďte další specifické inhibitory proteáz.
• Optimalizujte koncentrace primární protilátky.
• Prodlužte dobu inkubace s primární protilátkou na několik hodin při teplotě +2 až +8 °C.
• Prodlužte dobu inkubace s Protein G Agarose (přes noc).
• Zkraťte dobu promývání. Použijte promývací pufry s nižší přísností (150 mM NaCl, bez detergentu).

Detekce

• Zvětšete množství proteinu naneseného na gel.
• Zkontrolujte, zda je blotování účinné.
• Prodlužte dobu detekce.

Vysoké pozadí

Příprava vzorku a imunoprecipitace
<./p>

• Vzorky s vysokým pozadím mohou vyžadovat několik kol preabsorpce, aby se odstranily všechny bílkoviny, které se nespecificky vážou na protein G.
• Po imunoprecipitaci prodlužte dobu promývání komplexu protilátka-protein G v agaróze. Zvyšte přísnost promývacích podmínek.
• Zvýšená úroveň signálů pozadí na blotu může být způsobena nespecifickým zachycením proteinů během centrifugace komplexů Protein G Agarose/antigen. Tomu lze předejít gravitační sedimentací komplexů místo centrifugace.

Detekce

• Používejte čisté vybavení, čerstvě připravené pufry a nové membrány.
• Snížit koncentraci bílkovin ve vzorku.
• Vyhnout se dotyku membrán. Používejte rukavice a tupé pinzety s neostrými hroty.

Nespecifické pásy

Před imunoprecipitačními kroky vzorek až třikrát pročistěte proteinovou agarózou G, abyste odstranili všechny proteiny, které se nespecificky vážou na protein G . Pokud nelze imunoglobuliny ze séra zcela odstranit během předčištění Protein G Agarose, doporučuje se před lýzou buněk použít podmínky bezsérové buněčné kultury. Alternativně lze Protein G Agarose předčistit požadovaným množstvím specifické protilátky a zbývající vazebná místa proteinu G zablokovat nespecifickými kontrolními protilátkami nebo sérem.