Recept na pufry TAE a TBE a video

Co je to trisacetát EDTA a trisborát EDTA?

Trisacetát EDTA (TAE) a trisborát EDTA (TBE) jsou dva nejběžnější pufry používané při elektroforéze nukleových kyselin. Jako pufry mají poměrně konstantní pH a díky koncentraci vodíkových iontů jsou schopny vést elektrický proud. Tyto vlastnosti jsou nezbytné pro gelovou elektroforézu, při níž se bílkoviny oddělují podle elektrického náboje.

Příprava pufrů

TBE a TAE se nejčastěji míchají ze svých složek do laboratorních zásobních roztoků. Oba pufry lze zakoupit v pracovní koncentraci nebo v práškové či koncentrované podobě, která se jednoduše připraví ředěním.

Pro přípravu TAE a TBE v běžných koncentracích zásobních roztoků viz níže uvedené recepty. Naše kalkulačka pufrů vám také pomůže najít správné ředění (nebo přepočet) různých pufrů ze zásobního roztoku na požadovanou molaritu a objem.

Video:

Podívejte se na běžné receptury pufrů TAE a TBE a zjistěte, jaký pufr zvolit pro aplikaci gelové elektroforézy nukleových kyselin. Specialista na výzkumné technologie Chris Lemke namíchá zásobní roztoky a poskytne užitečné tipy pro výběr pufru.

Toto video vzniklo ve spolupráci s Seeding Labs, neziskovou organizací, která propojuje univerzity a výzkumné ústavy v rozvojových zemích s vysoce kvalitním přebytečným laboratorním vybavením, školeními a odbornými výměnami.

Recept na zásobu 50x pufruTAE

• 242 g tris báze v dvakrát destilovaném H₂O
  
• 57.1 ml kyselina ledová
• 100 ml 0.5 M EDTA roztoku (pH 8.0)

Objem upravte na 1 l.

Recept na 10x TAE

Pro 1 l 10x roztoku,

• 48.5 g tris
• 11.4 ml kyselina ledová
• 20 ml 0.5M EDTA (pH 8,0)

1x TAE Recept

Ředí se 1:10

• 0.4 M acetátu tridraselného (pH přibližně 8.3)
  
• 0,01 M EDTA

použití ultračisté vody.

Recept na 10x zásobní pufr TBE

• 108 g tris báze
• 55 g kyseliny borité
• 900 ml dvakrát destilovaného H₂O
• 40 ml 0.5 M EDTA roztok (pH 8,0)

Upravte objem na 1 l.

Příprava 1x TBE

Zřeďte 10x koncentrovaný pufr TBE 10x ultračistou vodou.

Konečný roztok by měl obsahovat:

• 0,13 M tris (pH 7.6)
• 45 mM kyseliny borité
• 2.5 mM EDTA

Tipy pro přípravu pufru

• Pokud je přítomna srážlivost, zahřejte ji na 37 °C a před ředěním promíchejte do úplného rozpuštění.
  
• Doporučuje se 1x pracovní roztoky před použitím přefiltrovat přes 0,2 mm filtr.
• 1x pracovní roztoky lze používat až do data použitelnosti uvedeného na obalu při skladování při pokojové teplotě. Pokud se pufr zakalí nebo změní barvu, zlikvidujte jej.

Srovnávací graf TAE vs. TBE

	TBE Buffer	TAE Buffer	Poznámky
Kapacita pufru	Vysoká	Nízká	TAE se vyčerpá při delší nebo opakované elektroforéze.
Migrace DNA	Pomalá	Rychlá	TAE má lepší vodivost.
Rozlišení	Vysoké rozlišení <2KB fragmentů DNA	Vysoké rozlišení >2KB fragmentů DNA	TBE podporuje příčné vazby v agaróze.
Inhibitor enzymů	Ano	Ne	Boritany z TBE inhibují mnoho enzymů.
Cena	Vyšší	Nižší

Použití

Prováděcí pufr tris-acetát-EDTA (TAE) a tris-borát-EDTA (TBE) jsou běžně používané pufry pro agarózovou gelovou elektroforézu DNA, které jsou užitečné zejména při přípravné práci.¹

V porovnání s tris-borát-EDTA (TBE) a tris-fosfát-EDTA (TPE) pufry má dvouvláknová DNA tendenci probíhat v TAE rychleji. Protože však TAE má ze všech tří pufrů nejnižší pufrovací kapacitu, může se během delší elektroforézy vyčerpat. Tuto situaci může napravit cirkulace pufru nebo jeho výměna.

TAE

Pufr 1x TAE se používá jak v agarózovém gelu tak jako používaný pufr. Pro dosažení maximálního rozlišení se doporučuje použít napětí  5 V/cm (vzdálenost mezi elektrodami přístroje).²

PufrTAE byl využit při agarózové gelové elektroforéze RNA.^3,4

Byla popsána studie volné mobility roztoku DNA v TAE při různých koncentracích pufru, v přítomnosti a nepřítomnosti přidaného NaCl.⁵

Bylo popsáno použití pufru TAE v denaturační gradientové metodě gelové elektroforézy pro analýzu mutací širokého rozsahu.

TBE

Pufr TBE se doporučuje pro rozlišení fragmentů RNA a DNA menších než 1500 bp.

TBE se používá jak s nedenaturovanými, tak denaturovanými (7 M močovina) gely.

Rutinně se také používá pro automatické sekvenování DNA gel.

Tris-borát-EDTA pufr se používá pro elektroforézu v gelu s pulzním polem (PFGE). Pro dosažení maximálního rozlišení se doporučuje použít napětí nižší než 5 V/cm.

Bionický pufr je jedinečnou alternativou k tradičním elektroforézním pufrům TBE (tris-borát-EDTA) a TAE (tris-acetát-EDTA). Bionic Buffer umožňuje:

• Rozlišení pásů v minutách
• Běh gelů 2-3x rychlejší než v TBE/TAE
• Vylepšení pásů za kratší dobu
• Použití s předlitými gely

Odkazy

1. Ogden RC, Adams DA. 1987. [8] Electrophoresis in agarose and acrylamide gels.61-87. https://doi.org/10.1016/0076-6879(87)52011-0

2. Sambrook, J, Russell, DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, . 3rd ed., pp. 5.8, 5.76, A1.16.. CSHL Press (Cold Spring Harbor, NY), .

3. Loening U. 1967. The fractionation of high-molecular-weight ribonucleic acid by polyacrylamide-gel electrophoresis. 102(1):251-257. https://doi.org/10.1042/bj1020251

4. Masters DB. 1992. High sensitivity quantification of RNA from gels and autoradiograms with affordable optical scanning. Biotechniques. 12(6):902-906, 908-911.

5. Stellwagen E, Stellwagen N. 2002. The free solution mobility of DNA in Tris-acetate-EDTA buffers of different concentrations, with and without added NaCl. Electrophoresis. 23 (12):1935-1941.

6. Hayes V. 1999. Improvements in gel composition and electrophoretic conditions for broad-range mutation analysis by denaturing gradient gel electrophoresis. 27(20):29e-29. https://doi.org/10.1093/nar/27.20.e29