Protokoly pro kultivaci indukovaných pluripotentních kmenových buněk

• Úvod
• Metody
• Kryoprezervace lidských IPSCS
• Tipy pro řešení problémů
• Související produkty 

Úvod

Indukované pluripotentní kmenové buňky  (iPSC) mají schopnost dát vzniknout diferencovanému potomstvu reprezentujícímu všechny tři zárodečné vrstvy těla: a mezodermu. V tomto případě se jedná o tři základní vrstvy lidského těla: ektoderm, endoderm a mezoderm. Schopnost expanze lidských iPSC in vitro a jejich podrobení diferenciačním protokolům specifickým pro jednotlivé buněčné typy má zásadní význam pro vytváření buněčných modelů odvozených od pacientů "nemoc v misce" pro základní výzkum kmenových buněk a aplikace při objevování léčiv.

Tento průvodce protokolem podrobně popisuje kroky, jak rozmrazit, kultivovat a kryoprezervovat lidské iPSC dodané Evropskou bankou indukovaných pluripotentních kmenových buněk  (EBiSC). Linie lidských indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC) se liší od všech ostatních zavedených buněčných linií. Pokud nejste obeznámeni s kultivací iPSC, ujistěte se, že jste si pozorně přečetli následující pokyny.

Klíčové body pro úspěch

• Před zahájením si pečlivě přečtěte tyto pokyny, včetně částí o potřebných činidlech, rozmrazování, pasážování, bezpečnostních opatřeních a tipech pro řešení problémů.
• Před rozmrazováním buněk se ujistěte, že máte k dispozici všechna potřebná činidla.
• Používejte správnou kombinaci médií a matric. iPSC vyžadují specializovaná média a kultivační podmínky.
• Ujistěte se, že je vaše zařízení pravidelně kalibrováno a že žádná činidla nejsou prošlá.

Metody

V certifikátu analýzy (CofA) jsou uvedena doporučení pro rozmrazování buněk v médiích a matrici, která jsou specifická pro každou buněčnou linii. V případě potřeby lze použitou matrici a médium změnit na alternativní pouze během pasážování. Po změně  média nebo matrice mohou buňky potřebovat čas na adaptaci. Pokud se nepoužije doporučený  systém tkáňové kultivace, nelze zaručit životaschopnost nebo kvalitu buněk.

Příprava extracelulární matrix

Příprava extraktu bazální membrány (BME)

Gelová matrice ECM kvalifikovaná pro kmenové buňky (CC131) je rozpustný extrakt bazální membrány (BME) purifikovaný z nádorů Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), který byl předem kvalifikován pro kultivaci lidských ES/iPS buněk. Matrice polymerizuje při 20-40 °C a vytváří rekonstituovanou bazální membránu. Produkt obsahuje mimo jiné laminin, kolagen IV, entaktin a heparan sulfát. Matrice odstraňuje potřebu časově náročného předskriptování a identifikace šarže, poskytuje optimalizovaný povlak ECM nezbytný pro dlouhodobou kultivaci pluripotentních lidských ES/iPS buněk a podporuje kultivaci lidských ES/iPS buněk v několika expanzních médiích bez séra/krmiva pro lidské ES/iPS buňky (tj. mTeSR^®, PluriSTEM™). Níže jsou uvedeny obecné pokyny pro potahování 6jamkových destiček pomocí gelové matrice ECM Qualified pro kmenové buňky.  Všechny postupy by měly být prováděny za aseptických podmínek v kabinetu biologické bezpečnosti.

1. Den před použitím rozmrazte gelovou matrici ECM (CC131) v chladničce o teplotě 2-8 °C. Poté ji vložte do chladničky o teplotě 2-8 °C a nechte ji odležet. Po rozmrazení udržujte ECM Gel po celou dobu na ledu a používejte předem vychlazené médium a pipety, abyste zabránili želírování přípravku.
2. Zřeďte ECM Gel Matrix (CC131). 1:80 se studeným médiem DMEM/F12 (D6421).  Škálujte nahoru nebo dolů podle požadovaných objemů.  Níže je uveden příklad pro potažení 6jamkové destičky 1,5 ml gelu ECM naředěného v poměru 1:80.
   Chcete-li vytvořit ředění 1:20, přidejte 0,5 ml ECM gelu do 9,5 ml studeného média DMEM/F12 nebo DMEM do 15ml kónické zkumavky.  Celkový objem = 10 ml.
   Pro vytvoření konečného ředění 1:80 je nutné další čtyřnásobné ředění.  Přidejte 2,5 ml ECM gelu ředěného v poměru 1:20 do 7,5 ml studeného média DMEM/F12.  Celkový objem = 10 ml
   POZNÁMKA: Doporučené ředění je 1:80, avšak v případě potřeby lze použít koncentrovanější ECM gel kvalifikovaný pro kmenové buňky.
3. Přidejte 1,5 ml matrice ECM Gel (CC131) naředěné v poměru 1:80 do každé jamky šestijamkové destičky.  Kultivační destičky otáčejte, aby se ECM Gel Matrix rovnoměrně rozprostřel po povrchu destičky.  Před použitím uchovávejte v chladničce o teplotě 2 - 8 °C přes noc nebo alespoň 2 hodiny v chladničce.  Pokud nepoužijete kultivační destičky potažené ECM okamžitě, zabalte je do parafilmu a uchovávejte při teplotě 2-8^°C až do doby, než budou připraveny k použití. Kultivační destičky potažené ECM použijte do 3 až 4 dnů.
4. Před nasazením buněk uveďte destičku na 10 až 15 minut do pokojové teploty, odstraňte potahovací roztok a přidejte 3 ml/jamku růstového média pro lidské ES/iPSC (SCM130). Nyní lze na nově potažené destičky nanášet buňky.

DŮLEŽITÉ:  Nenechte destičky vyschnout.

Příprava vitronektinu

1. Po obdržení skladujte vitronektin (CC130) při teplotě -80 °C. Před použitím rozmrazte zásobní lahvičku Vitronektinu při pokojové teplotě a připravte 60 μl alikvoty do sterilních polypropylenových zkumavek. Alikvoty zmrazte při teplotě -80 °C nebo je použijte okamžitě. Jedna 60 μl alikvotní část postačí k pokrytí všech jamek šestijamkové destičky.
2. Pro přípravu vitronektinu o pracovní koncentraci 0,5 μl je třeba připravit 0,5 μl alikvotní část.5μg/cm², zřeďte Vitronektin 1:100 jemným smícháním 6 ml PBS o pokojové teplotě (D8537) s 60 μl Vitronektinu. Přidejte 1 ml naředěného Vitronektinu do každé jamky 6jamkové destičky.
3. Inkubujte potažené kultivační nádoby při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. V případě potřeby skladování lze nádobky uzavřít fólií Parafilm^®  (P7793) a skladovat při teplotě 2-8 °C po dobu až 3 dnů. Před použitím nechte nádobu 1 hodinu vyrovnat na pokojovou teplotu.
4. Pro přípravu nádoby ke kultivaci odstraňte přebytečný Vitronectin z kultivační nádoby a zlikvidujte jej. Po odstranění Vitronektinu není nutné kultivační nádobu vymývat.

Příprava médií pro buněčné kultury

mTeSR™-1 Media

1. Pokud je to nutné, vyjměte doplněk mTeSR™1 (5x) z mrazničky a před použitím jej přes noc rozmrazte při teplotě 2-8 °C. Neprovádějte rozmrazování při 37 °C.
2. Asepticky přidejte 100 ml doplňku mTeSR™1 (5x) do 400 ml studeného (2-8 °C) základního média.
3. Alikujte médium do objemů potřebných pro 1 týden kultivační práce.
4. Kompletní mTeSR™1 lze skladovat při 2-8 °C po dobu 1 týdne nebo při -20 °C po dobu 6 měsíců. Zmrazený kompletní mTeSR™1 lze jednou rozmrazit. Nezmrazujte opakovaně rozmrazované médium. Před použitím zahřejte mTeSR™1 na pokojovou teplotu. Nenechávejte médium při pokojové teplotě déle než 2 hodiny denně a nevystavujte ho světlu, aby nedošlo k degradaci složek média.

Médium Essential 8™ (TeSR™-E8)

1. Pokud je to nutné, vyjměte doplněk E8 (50x) z mrazničky a před použitím jej přes noc rozmrazte při teplotě 2-8 °C. Ne rozmrazovat při 37 °C.
2. Asepticky odeberte 10 ml základního média E8, aby zůstalo 490 ml.
3. Přidejte 10 ml doplňku E8 (50x) ke 490 ml základního studeného (2-8 °C) média.
4. Alikujte médium do objemů potřebných pro 1 týden kultivační práce.
5. Kompletní E8 lze skladovat při teplotě 2-8 °C po dobu 1 týdne nebo při -20 °C po dobu 6 měsíců. Zmrazený kompletní E8 lze jednou rozmrazit. Nezmrazujte opakovaně rozmrazované médium. Před použitím zahřejte E8 na pokojovou teplotu. Nenechávejte médium při pokojové teplotě déle než 2 hodiny denně a nevystavujte ho světlu, aby nedošlo k degradaci složek média.

PluriSTEM^® Médium pro lidské ES/iPSC

PluriSTEM^® médium (SCM130, SCM132) je kompletní bezsérové médium na bázi malých molekul, které umožňuje kultivaci lidských ES/iPS buněk bez podavače a umožňuje výměnu média každý druhý den, aniž by byla ohrožena morfologie nebo dlouhodobá funkčnost. Médium je kompletní a nevyžaduje další doplňování. V případě potřeby vyjměte médium z mrazničky a před použitím jej přes noc rozmrazte při teplotě 2-8 °C. Neprovádějte rozmrazování při teplotě 37 °C. Po rozmrazení by se média PluriSTEM^® měla skladovat při teplotě 2-8 °C a použít do dvou týdnů.

 

Rozmrazování lidských iPSC./h3>

1. Buňky by se měly rychle rozmrazit umístěním kryovialu do vodní lázně nastavené na udržování teploty 37 °C. Kryovialku ve vodní lázni jemně otáčejte, abyste zajistili rychlé rozmrazení, ale neponořujte víčko kryovialky. Před otevřením kryovialku dezinfikujte 70% ethanolem  (793213) nebo ekvivalentním dezinfekčním prostředkem.
2. Sterilní pipetou o objemu 5 ml přeneste směs kryoprotektiva a buněk z kryovialky do 15ml centrifugační zkumavky. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k fyzickému poškození buněk.
3. K buňkám v 15 ml centrifugační zkumavce pomalu, po kapkách, přidejte 10 ml vhodného média při pokojové teplotě. Při přidávání kapek média jemně kývejte 15 ml odstředivkou sem a tam. Jedná se o zásadní krok, který minimalizuje osmotický šok pro buňky a pomáhá zajistit, aby byly buňky ošetřeny co nejšetrněji.
4. Zkontrolujte zkumavku, zda je odstraněn veškerý obsah buněk. V případě potřeby ji vypláchněte 1 ml vhodného média.
5. Malé množství buněk lze použít k provedení buněčného testu. Suspenze jednotlivých buněk by měla být vytvořena pomocí trypsinu nebo jiného vhodného média pro oddělování buněk. Jako obecné vodítko lze uvést, že rozmezí hustoty výsevu pro jednu jamku šestijamkové destičky je mezi 2x10⁵ - 1x10⁶ životaschopných buněk. Pokyny pro konkrétní číslo šarže buněčné linie EBiSC naleznete v CofA.
6. Celky odstřeďte při 200 x g po dobu 2 minut. Odstraňte a zlikvidujte supernatant.
7. Připravte kultivační nádoby přidáním odpovídajícího množství média (například 1,5 - 2 ml na jednu jamku šestijamkové destičky).
8. Poklepejte jemně na 15ml odstředivku, aby se uvolnila buněčná peleta, poté opatrně přidejte 1 ml vhodného média a nasypte do 2 jamek potažené 6jamkové destičky (upravte, pokud používáte jiné kultivační formáty nebo pokud je v certifikátu analýzy doporučeno jinak). Nepřečerpávejte buňky, protože by to vedlo ke snížení životaschopnosti v důsledku vytvoření jediné buněčné suspenze.
9. Jemně pohupujte destičkou ze strany na stranu a tam a zpět, aby se buňky rovnoměrně rozprostřely po jamce.
10. Doporučuje se zaznamenat snímky buněk ihned po rozmrazení, po 48 hodinách a při přibližně 70-80%  konfluenci.

Kultivace lidských iPSC

1. Dobrou praxí je denně pozorovat linie iPSC pod mikroskopem s fázovým kontrastem (zvětšení 4x, 10x, 20x a 40x) a kontrolovat morfologii podobnou iPSC, přítomnost diferencovaných buněk a konfluenci. Typické bodové hodnocení je uvedeno níže:

Třída	Popis
A	Optimální, zhuštěné kolonie iPSC s definovanými okraji; morfologie je napříč koloniemi jednotná
B	.Přijatelné kolonie iPSC s určitou diferenciací na okrajích, buňky volněji uspořádané v rámci kolonií
C	Dobrá přilnavost s malými vznikajícími koloniemi iPSC
D	Slabá přilnavost a žádné zjevné iPSC

Obrázek 1. Bodování kolonií iPSC

Obrázek 2. Úrovně diferenciace v kulturách iPSC

2. Buňky se krmí tak, že se z jamek odstraní ~ 95 % média pomocí aspirační pipety. Neodstraňujte médium úplně; tenký film média by měl pokrývat vrstvu buněk, aby nedošlo k jejich vysušení.
3. Asepticky přidejte 2 ml čerstvého média na 1 jamku šestijamkové destičky jemným přidáním na stranu jamky. Inkubujte buňky při teplotě 37 °C/ 5 % CO₂.
4. Typicky se médium vyměňuje denně po šesti ze sedmi dnů se zvýšeným objemem média (1,5x-2x normální množství; závisí na hustotě buněk), pokud je třeba ponechat buňky delší dobu mezi výměnami média. Nepřekračujte dva dny mezi výměnami média.

Pasážování lidských iPSC

EZ-LiFT™ Reagent Passaging Protocol

1. Před zahájením zahřejte EZ-LiFT™ Reagent (SCM139) na teplotu 37 °C. V případě, že se jedná o pasážování, je třeba provést analýzu.
2. Odstříkejte kultivační médium a jamky dvakrát promyjte 1.5 ml činidla EZ-LiFT™ Reagent (SCM139).
3. Přidejte 1 ml činidla EZ-LiFT™ (SCM139) do každé jamky. Inkubujte destičku při 37 °C po dobu 4 minut. 
4. Po 4 minutách rychle poklepejte na dno destičky (i.20-25 poklepání během 5 sekund). 
5. Přemístěte destičku zpět do inkubátoru na 37 °C na další 4 minuty.
6. Po 4 minutách rychle poklepejte na dno destičky (tj.. 20-25 poklepání za 5 s)
7. Provedete rychlou kontrolu jamky (jamek) mikroskopem.
   1. Vložte do misky s mikroskopem a zkontrolujte, zda je v ní (v nich) dostatek vody. Pokud je viditelný značný počet oddělených shluků, přejděte ke kroku 8.
   2. Pokud nepozorujete žádné zjevné odštěpení, opakujte kroky 4-7 s tím rozdílem, že v kroku 5 by inkubace při 37 °C
      měla trvat 2 minuty místo 4 minut.  Přejděte ke kroku 8.
8. Opatrně odeberte buněčnou suspenzi (~1 ml) a přeneste ji do 15ml kónické zkumavky.  Neutralizujte 5 ml kultivačního média jemným přidáním média k buněčné suspenzi.  Nepipetujte nahoru a dolů, protože by mohlo dojít k rozbití buněčných shluků na jednobuněčnou suspenzi.
9. Centrifugujte při 800 otáčkách za minutu po dobu 3 minut. Odsajte supernatant.
10. Buněčnou peletu jemně resuspendujte v 1 ml média podporujícího pluripotenci, například PluriSTEM^® (SCM130).  Nepipetujte nahoru a dolů více než dvakrát.  Nadměrné pipetování může mít za následek disociaci jednotlivých buněk. 
11. Disociované shluky buněk propasírujte do nově potažených 6jamkových destiček. Poměr rozdělení by měl být mezi 1:6 a  1:30. Denně sledujte buňky. Buňky obvykle dosáhnou 60-80% konfluence za 6-8 dní v závislosti na poměru rozdělení.

Protokol pasážování akutázy

1. Aliquot sufficient PluriSTEM^® (SCM130), Accutase (A6964) a DMEM/F12 (D6421) k pasážování buněk. Reagencie zahřejte při pokojové teplotě.
2. Jednu hodinu před pasážováním buněk přidejte do každé jamky šestijamkové destičky inhibitor ROCK (ROCKi), Y-27632 (SCM075) v konečné koncentraci 10 μM.
3. Po 1 hodině použijte pitevní mikroskop k vizuální kontrole destičky obsahující lidské pluripotentní buňky, které mají být pasážovány. Odstraňte oblasti se spontánní diferenciací.
4. Vyškrábané oblasti z jamky přelejte médiem obsahujícím buňky. Propláchněte 2 ml na jamku médiem DMEM/F-12 (D6421) nebo 1X PBS (D8537).
5. Odstříkněte a nahraďte 1 ml Accutase (A6964) na jamku šestijamkové destičky. Inkubujte při 37 °C po dobu 8-10 minut.
6. Ochlaďte reakci Accutase přidáním 1 ml PluriSTEM^® média (SCM130) na každý ml použité Accutase. Jemně oddělte buňky pomocí sterilní špičky 1000 μl pipety.
7. Disociované buňky shromážděte do 15ml kónické zkumavky. Jamky vypláchněte dalšími 2 ml média PluriSTEM^® (SCM130), abyste shromáždili všechny zbývající buňky. Přidejte výplach do 15ml kónické zkumavky.
8. Centrifugujte 15ml kónickou zkumavku obsahující buněčnou suspenzi při 300 x g po dobu 5 minut při pokojové teplotě.
9. Vysajte supernatant. Resuspendujte buňky v čerstvém médiu PluriSTEM^® (.SCM130)  obsahující 10 μM inhibitoru ROCK, Y-27632 (SCM075).
10. Spočítejte počet buněk pomocí počítadla buněk Scepter™ nebo hemocytometru. Ujistěte se, že buňky jsou v jedné buněčné suspenzi. Stanovte životaschopnost buněk pomocí vyloučení Trypanovou modří (T8154).
11. Nastavte titraci různých hustot buněk v rozmezí 0,5 -1x10⁴ buněk/cm². To odpovídá 50 000 - 100 000 buňkám na jamku šestijamkové destičky potažené Matrigelem v médiu PluriSTEM^® obsahujícím 10 μM inhibitoru ROCK.
12. Druhý den vyměňte za čerstvé médium PluriSTEM^® (SCM130). Každé 2 dny vyměňte za čerstvé médium PluriSTEM^® (SCM130) (objem 3 ml na jamku). Buňky lze pasážovat každých 5-7 dní.

Protokol pasážování dispázy

1. Dostatečné množství dispázy II, 1 mg/ml (<.a href="/CZ/cs/product/mm/cc130">CC130) a DMEM/F12 (D6421) k pasážování buněk. Reagencie zahřejte na pokojovou teplotu.
2. Pomocí pitevního mikroskopu vizuálně zkontrolujte destičku obsahující lidské pluripotentní buňky určené k pasážování. Zkontrolujte, zda kolonie neobsahují oblasti spontánní diferenciace.
3. Pomocí sterilní špičky pipety p200 připojené k pipetovacímu zařízení p200 seškrábněte oblasti spontánní diferenciace.
4. Vysajte médium obsahující buňky ze seškrábnutých oblastí z jamky. Vypláchněte 2 ml na jamku média DMEM/F-12 (D6421) nebo 1X PBS (D8537).
5. Přidejte 1 ml Dispázy II, 1 mg/ml (CC130) na jamku 6jamkové destičky obsahující pluripotentní lidské ES nebo iPS buňky, které mají být pasážovány.
6. Inkubujte při 37 °C po dobu 6-7 minut. Po inkubaci vizuálně zkontrolujte kolonie pod mikroskopem. Okraje kolonií se mohou zdát mírně zaoblené a/nebo ohnuté od povrchu destičky, ale většina kolonií by měla být stále přichycena k destičce.
7. Odstraníme Dispázu II (CC130) a každou jamku dvakrát jemně propláchneme 2 ml 1X PBS (D8537) nebo médiem DMEM/F12 (D6421).
8. Přidejte 1,5-2 ml média PluriSTEM^® (SCM130) do každé jamky. Jemně oddělte kolonie pomocí buněčné škrabky.
9. Pomocí 5ml serologické pipety shromážděte buněčné agregáty do 15ml kónické zkumavky. Minimalizujte pipetování nahoru a dolů, protože by mohlo dojít k rozbití kolonií na suboptimální malé kousky.
10. Vypláchněte jamky dalšími 2 ml média PluriSTEM^® (SCM130) na jamku, abyste zachytili všechny zbývající buněčné agregáty. Přidejte výplach do 15ml kónické zkumavky.
11. Centrifugujte 15ml kónickou zkumavku obsahující buněčné agregáty při 300 x g po dobu 5 minut při pokojové teplotě.
12. Vysajte supernatant. Resuspendujte buněčné agregáty v příslušném objemu média PluriSTEM^® (SCM130) pro pasážování. Rozdělte buňky v poměru 1:3 až 1:6, v závislosti na počtu buněčných shluků.
13. Přemístěte destičku do inkubátoru o teplotě 37 °C. Míchejte destičkou jemně ze strany na stranu a dopředu a dozadu, abyste zajistili rovnoměrné rozložení buněčných shluků po povrchu jamky.
14. Druhý den vyměňte 3 ml na jamku čerstvého média PluriSTEM^® (SCM130). Buňky lze pasážovat každých 5-7 dní.

Kryoprezervace lidských iPSC

1. Udržujte činidla a mrazicí nádobu (např.Mr. Frosty) během kryokonzervace chlazené.
2. Buňky je třeba kryokonzervovat, když jsou v logaritmické fázi růstu, aby se zvýšilo jejich přežití po rozmrazení. Optimální doba pro sklizeň je obvykle, když jsou buňky přibližně 70-80 % konfluentní
3. Typ použitého kryoprotektivního média závisí na podmínkách kultivace a preferencích laboratoře. Použijte buď komerčně dostupný přípravek Cryostor^® CS10 (C2874) nebo mrazicí směs na bázi DMSO (D2650) (10% DMSO v FBS a kultivačním médiu). Médium Cryostor^® se dodává připravené k použití a skladuje se při teplotě 2-8 °C. Pro přípravu kryoprotektiva na bázi DMSO smíchejte 40 % FBS s 10 % DMSO a poté smíchejte s 50 % příslušného média.
4. Odstraňte spotřebované médium z nádoby pro tkáňové kultury a dvakrát nádobu promyjte doporučeným objemem promývacího pufru v závislosti na podmínkách kultivace (Promývací pufr pro Cultrex/Matrigel je 0,5 ml.5mM EDTA; promývací pufr pro Vitronectin je PBS).
5. Pro vyjmutí buněk z plastové tkáňové kultury přidejte do nádoby s tkáňovou kulturou 1 ml 0,5mM EDTA (03690). Inkubujte buňky po doporučenou dobu a teplotu v závislosti na použité matrici. Odsajte EDTA z jamky. Je třeba dbát na to, aby kolonie byly velmi volně přichyceny k plastu.
6. Přidejte 1 ml kryoprotektantu na jamku. Jemně propláchněte kryoprotektant po nádobce sterilní pipetou o objemu 1 ml, aby se buňky odlepily od plastu. Neaspirujte více než 3krát, aby nedošlo k disociaci buněčných shluků na jednotlivé buňky. Umístěte kryoprotektant a směs buněk do vhodně označené kryovialky.
7. Pokud je požadována kryokonzervace více jamek, měly by být buňky ze stejného čísla pasáže a kultivačních podmínek spojeny dohromady. Alikvotní část sdružených buněk lze použít pro počítání buněk. Sklizené buňky odstřeďujte při 200xg po dobu 2 minut, odsajte použité médium a jemně resuspendujte buněčnou peletu v příslušném objemu kryoprotektiva. Jedna jamka šestijamkové destičky dává přibližně 1-2 x 10⁶ buněk. Doporučuje se zmrazit přibližně 1-2 x 10⁶ buněk na jednu kryovialku. Na jednu kryovialku použijte 1 ml směsi kryoprotektantu a buněk.
8. Kryovialky ihned vložte do předem vychlazené (2-8 °C) vaničky Mr. Frosty a poté vaničku Mr. Frosty ihned přeneste do mrazničky o teplotě -80 °C. Nechte buňky zůstat při -80 °C přes noc (16-36 hodin). Po zmrazení přeneste buňky na suchém ledu do nádoby pro skladování při velmi nízkých teplotách (kapalný introgen nebo mraznička o teplotě -150 °C).

Charakterizace lidských iPSC

Nediferencovaný stav iPSC je charakterizován vysokou úrovní exprese alkalické fosfatázy (SCR004) a transkripčních faktorů kmenových buněk Nanog, Oct-4 a Sox-2. V případě, že iPSC jsou v nediferencovaném stavu, je jejich exprese vysoká. Tyto buňky také vykazují výrazné rozdíly od svých myších protějšků, pokud jde o expresi markerů specifických pro stadium embryonálního antigenu (SSEA1, 3, 4) a podokalyxinu (TRA-1-60, TRA-1-81). Buňky lze analyzovat pomocí barvení ICC protilátkami s použitím souprav pro charakterizaci kmenových buněk (SCR001, SCR002, SCR078) nebo pomocí PCR analýzy.

Tabulka 1. Souhrn lidských iPSC markerů

Typ buňky	Alkalická fosfatáza	Oct-4	Sox-2	Nanog	SSEA-4	TRA-1-60	TRA-1-81
Human iPSC	+	+	+	+	-	+	+<	+	+
Myší iPSC

Obrázek 3. Pluripotentní iPS buňky exprimují markery pluripotence. Alkalická fosfatáza (40x) (A), Oct-4 Alexa 488 (MAB4401A4, 400x) (B), Sox-2 Cy3 (MAB4423C3, 100x) (C), Nanog Alexa 488 (MABD24A4, 400x) (D), TRA-1-60 Cy3 (MAB4360C3, 100x) (E) a TRA-1-81-Cy3 (MAB4381C3, 100x) (F). Jádra byla kontrastně obarvena DAPI (modře) (D9542).

 

Tipy pro řešení problémů

Problém	Pozorování	Řešení
Nízká životaschopnost iPSC<.br /> po rozmrazení	- Malé nebo žádné viditelné kolonie do 4 dnů po obnovení	- Zajistěte rychlé rozmrazení kryovialů a velmi pomalé přidávání média k buňkám (po kapkách za současného jemného otáčení zkumavkou) - Při rozmrazování přidejte 10μm inhibitoru ROCK, ale nepoužívejte jej rutinně - Při rozmrazování přidejte 10μm inhibitoru ROCK.br /> - Ujistěte se, že buňky byly bankovány v logaritmické fázi růstu s nízkou úrovní diferenciace - Nechte malé kolonie růst až do robustnosti a pasáže s nízkým poměrem dělení (1:1 nebo 1:
Nízká životaschopnost po pasáži	Podrobněji:	Nízká životaschopnost po pasáži	- Použijte nižší poměr dělení a udržujte konfluentnější kulturu - Zajistěte, aby byly buňky při pasážování v logaritmické fázi růstu - Pracujte rychle nebo zkraťte inkubační dobu EDTA, protože velikost shluků by mohla být ovlivněna příliš dlouhým působením EDTA - Prodlužte inkubační dobu EDTA, pokud se buňky snadno neoddělují. To proto, abyste nemuseli buňky příliš turbulentně proplachovat, čímž by se vytvořily příliš malé agregáty nebo suspenze z jediné buňky - Zkontrolujte, zda byly destičky správně potaženy, zda je matrice v expirační době, a zkontrolujte šarži u výrobce, pokud se tento problém vyskytuje pravidelně a jiné důvody byly vyloučeny
Spontánní diferenciace	- Kolonie nemají definované okraje - Zjistěte, zda jsou kolonie v pořádku. Buňky uvnitř kolonií jsou méně kompaktní - Buňky se zdají být zploštělé a velké nebo fibroblastické	- Ujistěte se, že jsou buňky kultivovány podle doporučení (tj.tj. každodenní krmení buněk) - Zajistěte, aby byla reagencie čerstvě připravena (tj. použita do dvou týdnů) - Nenechávejte destičky mimo inkubátor, abyste minimalizovali kolísání teploty a vystavení světlu. - Snižte hustotu kolonií tím, že během pasážování budete umisťovat méně buněčných agregátů na cm2 - Pokud mezi diferencovanými oblastmi přetrvávají dobré kolonie iPSC, lze zvážit ruční výběr kolonií s dobrou morfologií iPSC pomocí špičky pipety. Doporučuje se vybrat několik kolonií a rozříznout je pipetovou špičkou, zvednout je, odsát a poté pasážovat do čerstvé jamky 1:6. - Lze zvážit odstranění diferencovaných buněk seškrábnutím diferencovaných oblastí pipetovou špičkou s ponecháním kolonií iPSC vcelku. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k narušení kolonií iPSC a aby se při tomto postupu neseškrábalo příliš mnoho vrstvy matrix.
Nerovnoměrné rozmístění kolonií v rámci destičky	- Oblasti, kde je hustota iPS buněk příliš vysoká. Významné oblasti povrchu destičky mají málo kolonií nebo žádné.	- Ujistěte se, že celá plocha povrchu nádoby pro tkáňové kultury je rovnoměrně pokryta příslušnou matricí - Zajistěte, aby byly agregáty buněk rovnoměrně rozmístěny . jemně pohupujte destičkou tam a zpět a ze strany na stranu - Při umísťování destičky do inkubátoru dbejte na opatrnost a nechte nerušeně působit 24 hodin
Významné seškrabávání je br /> nutné k uvolnění buněk	- Kolonie se z destičky neuvolní ani po 2 - 3 propláchnutích 1 ml pipetou	- Ujistěte se, že doba inkubace a teplota EDTA jsou v souladu s matricí - Prodlužte dobu inkubace EDTA - Nedovolte, aby buňky byly více než 70 % konfluentní - Nedovolte, aby došlo k zarůstání vnitřku kolonií. Někdy je nutné propasírovat méně konfluentní destičku s menším počtem, ale robustních kolonií a použít nižší poměr dělení
Slabé uchycení a výrazné zvýšení odumírání buněk po pasáži	- Buňky se začnou z desky zvedat, přestože se zdálo, že se ihned po pasáži přichytí	- Místo výměny média doplňte jamky čerstvým médiem, abyste zajistili dostatečnou koncentraci živin, a nechte buňky nerušeně působit dalších 24 hodin, aby se agregáty plně přichytily - Vyměňte médium velmi opatrně. Nevystavujte kolonie nadměrným smykovým silám rychlým přidáním média