Protokoly pro kultivaci mezenchymálních kmenových buněk

Izolace mezenchymálních kmenových buněk
Podrobněji se věnujte této problematice.Expanze lidských mezenchymálních kmenových buněk
Diferenciace lidských mezenchymálních kmenových buněk
Často kladené otázky

Mezenchymální kmenové buňky  (MSC) mají schopnost víceřadé diferenciace, která dává vzniknout různým mezenchymálním fenotypům, jako jsou osteoblasty (kost), adipocyty (tuk) a chondrocyty (chrupavka). Terapie kmenovými buňkami je nesmírným příslibem, že přinese další generaci budoucích průlomových objevů v medicíně. V tomto ohledu vzbudily multipotentní progenitorové buňky, jako jsou hMSC, velký klinický zájem díky své schopnosti diferencovat se na různé buněčné typy a imunoregulačním vlastnostem. Tyto vlastnosti společně umožňují alogenní použití hMSC a činí z nich tak atraktivní cíl pro komerční terapeutický vývoj. Níže naleznete protokoly krok za krokem používané k izolaci, expanzi a správné diferenciaci MSC v kulturách kmenových buněk.

Prohlédněte si všechny produkty s mezenchymálními kmenovými buňkami

Metody

Isolation of Mesenchymal Stem Cells

Mezenchymální kmenové buňky byly izolovány z různých tkání včetně lidské kostní dřeně, tukové tkáně, pupečníku a zubní dřeně. Níže je uveden jednoduchý obecný protokol, který lze použít k získání MSC z různých tkáňových zdrojů.

Poznámka: Populace MSC se u jednotlivých dárců liší a může vyžadovat další optimalizaci.

1. Získejte čerstvé tkáňové aspiráty, které jsou odebrány za aseptických podmínek.
2. Buněčnou suspenzi přefiltrujte přes 70mm filtrační síťku (CLS431751), abyste odstranili případné shluky buněk.
3. Buňky peletujte při 500g po dobu 5 min ve stolní centrifuze.
4. Resuspendujte buňky a stanovte výtěžnost a životaschopnost buněk pomocí vyloučení Trypanovy modři (T8154)
5. Kultivujte buňky v kultivačních miskách T75 v 10 ml kompletního média MSC (SCM015 nebo SCM045) při hustotě 25 × 10⁶ buněk/mL. Inkubujte destičky při 37 °C s 5 % CO₂ ve zvlhčené komoře, aniž byste je rozrušovali.
6. Po 3 hodinách odstraňte neadherentní buňky, které se nahromadily na povrchu misky, výměnou média a nahrazením 10 ml čerstvého kompletního média.
7. Po dalších 8 hodinách kultivace nahraďte médium 10 ml čerstvého kompletního média. Poté tento krok opakujte každých 8 h až do 72 h počáteční kultivace.
8. Buňky lze zmrazit v růstovém médiu MSC plus 10% DMSO (D2650) v hustotě 2X10⁶ buněk/vialku.

Expanze lidských mezenchymálních kmenových buněk

A. Příprava potahovaných destiček

Plastové nebo skleněné destičky pro tkáňové kultury by měly být potaženy 0,1% želatinou následujícím způsobem:

1. Přidejte dostatečné množství 0,1% roztoku želatiny (ES-006-B), aby byl pokryt celý povrch destičky pro kultivaci. Pro desky o průměru 10 cm a baňky T75 použijte objem 10 ml. Inkubujte nejméně 30 minut při pokojové teplotě.
2. Těsně před použitím odsajte roztok želatiny z potažené desky nebo baňky.

B. Rozmrazování mezenchymálních kmenových buněk

1. Nezamrazujte buňky, dokud nemáte k dispozici doporučené médium a vhodně potažené plastové nádoby a/nebo sklo s 0,1% želatinou.
2. Vyjměte lahvičku s lidskými mezenchymálními kmenovými buňkami (SCC034, SCC038) z tekutého dusíku a inkubujte ji ve vodní lázni při teplotě 37 °C. Pečlivě sledujte, dokud buňky zcela nerozmrznou. Maximální životaschopnost buněk je závislá na rychlém a úplném rozmrazení zmrazených buněk.
   
   DŮLEŽITÉ: Buňky nevrtejte.
   
   
3. Jakmile jsou buňky zcela rozmrazeny, dezinfikujte vnější část lahvičky 70% etanolem. Okamžitě přejděte k dalšímu kroku.
4. V laminární digestoři přeneste buňky pomocí 1 nebo 2ml pipety do sterilní 15ml kónické zkumavky. Dávejte pozor, abyste při přenosu nevytvořili žádné bubliny.
5. Pomocí 10ml pipety pomalu po kapkách přidejte 9 ml expanzního média pro mezenchymální kmenové buňky (SCM015). nebo SCM045) nebo vhodnou alternativu dle výběru, předehřáté na 37 °C, do 15ml kónické zkumavky.
   
   DŮLEŽITÉ: Nepřidávejte k buňkám celý objem média najednou. To může mít za následek snížení životaschopnosti buněk v důsledku osmotického šoku.
   
   
6. Suspenzi buněk jemně promíchejte dvakrát pomalým pipetováním nahoru a dolů. Dávejte pozor, abyste nevnesli žádné bublinky.
   
   DŮLEŽITÉ: Buňky nevrtejte.
   
   
7. Centrifugujte zkumavku při 300 x g po dobu 2-3 minut, aby se buňky peletovaly.
8. Dekantujte co nejvíce supernatantu. Kroky 5-8 jsou nezbytné k odstranění zbytků kryokonzervačního prostředku (DMSO).
9. Resuspendujte buňky v celkovém objemu 10 ml média pro expanzi mezenchymálních kmenových buněk (SCM015 nebo SCM045) nebo vhodné alternativy dle výběru, předehřáté na 37 °C, obsahující čerstvě přidaných 8 ng/ml FGF-2 (F0291).
10. Na 10cm tkáňovou kultivační destičku nebo na tkáňovou kultivační baňku T75 naneste buněčnou suspenzi.
    
    DŮLEŽITÉ: Hustota výsevu by měla být 5 000-6 000 buněk/cm²
    
    
11. Udržujte buňky při 37 °C ve zvlhčeném inkubátoru vyrovnaném s 5 % CO₂.
12. Druhý den vyměňte médium za čerstvé médium pro expanzi mezenchymálních kmenových buněk (předehřáté na 37 °C) obsahující 8 ng/ml FGF-2*. Poté je každé dva až tři dny vyměňte za čerstvé médium obsahující FGF-2.
13. Když jsou buňky přibližně z 80 % konfluentní, lze je disociovat pomocí Trypsin-EDTA (SM-2003-C) a dále pasážovat nebo zmrazit pro pozdější použití.
    
    POZNÁMKA: V závislosti na hustotě výsevu a počtu pasáží (tj. pozdějších pasáží) může trvat déle, než buňky dosáhnou 80% konfluence.

C. Expanze mezenchymálních kmenových buněk

1. Subkulturujte buňky, jakmile dosáhnou přibližně 80% konfluence a aktivně proliferují.
   
   DŮLEŽITÉ: Subkulturujte buňky před dosažením 100% konfluence.
   
   
2. Opatrně odstraňte médium z desky pro tkáňové kultury o průměru 10 cm obsahující konfluentní vrstvu lidských mezenchymálních kmenových buněk. Naneste 3-5 ml roztoku trypsinu-EDTA (SM-2003-C) a inkubujte v inkubátoru při teplotě 37 °C po dobu 3-5 minut.
3. Podívejte se na destičku a ujistěte se, že došlo k úplnému oddělení buněk, jemným poklepáním dlaní na stranu destičky.
4. Přidejte na destičku 5 ml média pro expanzi mezenchymálních kmenových buněk (SCM015 nebo SCM045).
5. Mírným otáčením destičky promíchejte buněčnou suspenzi. Přeneste disociované buňky do 15ml kónické zkumavky.
6. Centrifugujte zkumavku při 300 x g po dobu 3-5 minut, aby se buňky peletovaly.
7. Supernatant vylijte
8. Do kónické zkumavky naneste 2 ml média pro expanzi mezenchymálních kmenových buněk (předehřátého na 37 °C) obsahujícího 8 ng/ml FGF-2 a buňky důkladně resuspendujte.
   
   DŮLEŽITÉ: Buňky nevířte.
   
   
9. Počítejte počet buněk pomocí hemocytometru.
10. Buňky rozložte v hustotě 5 000-6 000 buněk na cm² do příslušných baněk, destiček nebo jamek v médiu pro expanzi mezenchymálních kmenových buněk obsahujícím 8 ng/ml FGF-2.
11. Buňky lze zmrazit v růstovém médiu MSC plus 10% DMSO (D2650) v hustotě 2x10⁶ buněk/lahvičku.

Obrázek 1. Obrázky lidských mezenchymálních kmenových buněk s fázovým kontrastem jeden (A) a dva (B) dny po rozmrazení. Všimněte si vřetenovité morfologie podobné fibroblastům. Těsně před pasážováním by měly být buňky ~80% konfluentní.

Obrázek 2. ICC barvení kultivovaných mezenchymálních kmenových buněk odvozených z lidské kostní dřeně pomocí protilátek obsažených v sadě pro charakterizaci lidských mezenchymálních kmenových buněk. Lidské mezenchymální kmenové buňky exprimují H-CAM (CD44) (A, CBL154; ředění 1/500), THY-1 (CD90) (B, CBL415: ředění 1/500) a STRO-1 (C, MAB4315: ředění 1/500). Jádra buněk byla vizualizována pomocí DAPI (modře). Exprese markerů hematopoetických kmenových buněk, CD19 (MAB1794) a CD14 (MAB1219) a endoteliálního markeru, CD146 (MAB16985), nebyla u lidských mezenchymálních kmenových buněk pozorována (údaje nejsou uvedeny).

Diferenciace lidských mezenchymálních kmenových buněk

Osteogeneze mezenchymálních kmenových buněk

Při použití lidského fibronektinu, 20 µg/ml (FC010) nebo 0.1% želatinou (ES-006-B) potažené 48jamkové destičky pro tkáňové kultury vyséváme 20K buněk/jamku v 0.5 ml normálního růstového média MSC (SCM015 nebo SCM045). Po inkubaci přes noc vyměňte kultivační médium za diferenciační médium OsteoMAX-XF™ (SCM121). Média vyměňujte každé 2-3 dny po dobu celkem 14-21 dní. Osteocyty obarvené alizarinovou červení (TMS-008) se začnou tvořit kolem 7. dne s maximální expresí kolem 14. dne.

Adipogeneze mezenchymálních kmenových buněk

Při použití 24jamkové tkáňové kultivační destičky zasejte 60 000 buněk/jamku do 1 ml normálního růstového média MSC (SCM015 nebo SCM045). Po celonoční inkubaci nahraďte kultivační médium médiem AdipoMAX™ Differentiation Media (SCM122). Média vyměňujte každé 2 až 3 dny po dobu celkem 14-21 dní. Adipocyty obarvené olejem a červenou barvou (O1391) se začnou tvořit kolem 14. dne s maximální expresí kolem 21. dne.

Chondrogeneze mezenchymálních kmenových buněk

Mezenchymální kmenové buňky lze indukovat k diferenciaci na chondrocyty pomocí trojrozměrných mikrokultur buněk v agregátech.

1. Resuspendujte 2,5 x 10⁵ MSC v 5 ml předehřátého diferenciačního média ChondroMAX™ (SCM123).
2. Centrifugujte buňky při 200 g po dobu 5 minut.
3. Odstraňte médium a resuspendujte buňky s 0,5 ml předehřátého diferenciačního média ChondroMAX™.
4. Centrifugujte buňky při 200 g po dobu 5 minut. Médium neodstraňujte.
5. Odstraňte uzávěr zkumavky, aby byla umožněna výměna plynů, a inkubujte ve svislé poloze při 37 °C a 5 % CO₂.
6. Po 1 - 2 dnech se z buněčné pelety vytvoří kulatá kulička o průměru přibližně 1 - 2 mm. Každý druhý den opatrně vyměňte médium, aniž byste poškodili mikromasu pelet buněk. Po 21 dnech lze mikromasové kultury fixovat, rozřezat a obarvit Safraninem-O (TMS-009), Alcian-Blue (TMS-010) nebo protilátkami k identifikaci chondrocytů.

Obrázek 3. Barvení diferencovaných kultur lidských mezenchymálních kmenových buněk pomocí Oil-Red-O (adipocyty), Alizarin-Red (osteocyty), Safranin-O (chondrocyty) a Alcian-Blue (chondrocyty).

Často kladené otázky

1. Jak dlouho se MSC v kultuře rozšiřují? Doporučuje se začít s buňkami s nízkým číslem pasáže (≤P2), protože MSC zřídka expandují přes pasáž 5-10 (10 zdvojení populace).
2. Moje buňky již neproliferují, co mám dělat? Doporučuje se začít s novou čerstvou lahvičkou s buňkami s nízkým počtem pasáží.
3. Jaká je typická morfologie multipotentních MSC? MSC by měly mít vřetenovitý tvar/fibroblastickou morfologii. Při dosažení senescence se buňky zvětšují a stávají se méně fibroblastickými.
4. Jaké markery lze použít k charakterizaci MSC? MSC jednotně exprimují integrin CD29, matrixové receptory CD44, CD105 a markery spojené se stromálními buňkami CD73, CD90 a CD166. Buňky jsou negativní pro markery hematopoetické linie CD14, CD31, CD34 a CD45.
5. Jak poznám, kdy mám MSC rozdělit? Buňky rozdělte, když nejsou více než 80 % konfluentní.
6. Jakou správnou hustotu výsevu použít při pasážování MSC? Doporučujeme nové destičky s buňkami nasadit při hustotě 5000 buněk/cm²
7. Můžu ke kultivaci MSC použít FBS? K expanzi MSC lze použít média obsahující nízké koncentrace FBS (<1% FBS). Vzhledem ke své nedefinované povaze však musí být každá šarže FBS prověřena, zda podporuje růst MSC. Doporučujeme média PLTMax^® Human Platelet Lysate (SCM141) nebo Xeno-Free MSC media (SCM045), která takové předběžné prověření nevyžadují.