Protocolo do TRI Reagent^®

O que o TRI Reagent^® faz?

A solução do TRI Reagent^® (também vendido como TRIzol) é uma mistura de tiocianato de guanidina e fenol em uma solução monofásica que é usada para o isolamento de DNA, RNA e proteínas de amostras biológicas humanas, bem como de amostras de animais, plantas, leveduras, bactérias e vírus. Ela inibe a atividade das RNAses. O TRI Reagent^® é usado para homogeneizar a amostra biológica da qual se extrai o RNA, DNA ou proteínas.

Procedimentos

Preparo de amostras

1A. Tecido:
Homogeneíze as amostras de tecido em TRI Reagent (1 ml por 50–100 mg de tecido) em um Polytron^® ou outro homogeneizador apropriado.

Observação: Caso se deseje obter fragmentação mínima do DNA, use um homogeneizador com encaixe mais frouxo, não um Polytron (vide Isolamento de DNA, Etapa 3, observação b). O volume do tecido não deve exceder 10% do volume do TRI Reagent.

1B. Células em monocamada:
Faça a lise celular diretamente na placa de cultura. Utilize 1 ml do TRI Reagent por 10 cm² da área de superfície da placa de cultura de vidro. Após a adição do reagente, o lisado celular deve ser passado diversas vezes por uma pipeta para formar um lisado homogêneo.

Observação: O TRI Reagent não é compatível com placas de cultura de plástico.

1C. Células em suspensão:
Isole as células através da centrifugação e, em seguida, lise em TRI Reagent, pipetando repetidas vezes. Um ml do reagente é suficiente para lisar 5 a 10 × 10⁶ células de animais, plantas ou leveduras ou 10⁷ células bacterianas.

Observação:

• Se as amostras apresentarem um teor alto de gorduras, proteínas, polissacarídeos ou material extracelular como músculos, tecido adiposo, e partes de plantas tuberosas, pode ser necessário realizar uma etapa a mais. Após a homogeneização, centrifugue o homogenado a 12.000 × g por 10 minutos a uma temperatura de 2 a 8 °C para remover o material insolúvel (membranas extracelulares, polissacarídeos e DNA de alta massa molecular). O sobrenadante contém RNA e proteínas. Se a amostra possuir alto teor lipídico, haverá uma camada de material graxo que deve ser removida da superfície da fase aquosa. Transfira o sobrenadante claro para um tubo novo e prossiga com a etapa 2. Siga as etapas 2 e 3 do Isolamento de DNA, para recuperar o DNA de alta massa molecular do pélete.
• Algumas células de leveduras e de bactérias podem exigir o uso de um homogeneizador.
• Após a homogeneização ou lise celular em TRI Reagent, as amostras podem ser armazenadas a –70 °C por até 1 mês.

Separação de fases: Para garantir a dissociação completa dos complexos de nucleoproteínas, deixe as amostras em repouso por 5 minutos em temperatura ambiente. Adicione 0,1 ml de 1-bromo-3-cloropropano ou 0,2 ml de clorofórmio (vide Separação de fases, observações a e b) por ml de TRI Reagent usado. Cubra bem a amostra, agite vigorosamente por 15 segundos, e deixe repousar por 2 a 15 minutos em temperatura ambiente. Faça a centrifugação da mistura resultante a 12.000 × g por 15 minutos a uma temperatura de 2 a 8 °C. A centrifugação separa a mistura em 3 fases: a fase orgânica vermelha (contendo proteína), uma interfase (contendo DNA) e a fase aquosa incolor superior (contendo o RNA).

Observação:

• O 1-bromo-3-cloropropano é menos tóxico do que o clorofórmio e o seu uso para a separação de fases diminui as possibilidades de contaminação do RNA com DNA.⁴
• O clorofórmio usado para a separação de fases não deve conter álcool isoamílico ou outros aditivos.
• Para isolar a fração Poli A⁺ da fração aquosa, vide o Anexo I.

Extração ou isolamento de RNA

1. Transfira a fase aquosa para um tubo novo e adicione 0,5 ml de 2-propanol por ml de TRI Reagent usado na etapa 1 do Preparo de amostras, e misture. Deixe as amostras em repouso por 5 a 10 minutos em temperatura ambiente. Centrifugue o homogenado a 12.000 × g por 10 minutos a uma temperatura de 2 a 8 °C. O RNA se precipitará e formará um pélete na lateral e no fundo do tubo.

Observação: Armazene a interfase e a fase orgânica a uma temperatura de 2 a 8 °C para posterior isolamento de DNA e de proteínas.

2. Remova o sobrenadante e lave o pélete de RNA com a adição de no mínimo 1 ml de etanol 75% por 1 ml de TRI Reagent usado na etapa 1 do Preparo de amostras. Agite a amostra no vórtex e, em seguida, centrifugue a 7.500 × g por 5 minutos a uma temperatura de 2 a 8 °C.

Observação:

• Se os péletes de RNA flutuarem, realize a lavagem em etanol 75% a 12.000 × g.
• As amostras podem ser armazenadas em etanol a temperaturas de 2 a 8 °C por pelo menos 1 semana ou por até 1 ano a –20 °C.

3. Deixe o pélete de RNA secar brevemente por 5 a 10 minutos ao ar ou sob vácuo. Não deixe o pélete de RNA secar completamente pois isso reduzirá muito a sua solubilidade. Não seque o pélete de RNA por centrifugação sob vácuo (Speed-Vac®). Adicione uma quantidade apropriada de formamida, água, ou uma solução de SDS 0,5% ao pélete de RNA. Para facilitar a dissolução, misture repetidamente com a micropipeta a uma temperatura de 55 a 60 °C por 10 a 15 minutos.

Observação:

• O preparo final de RNA não contém DNA nem proteínas. Ela deve ter uma razão de A260 para A280 ≥ 1,7.
• Rendimento típico dos tecidos (mg de RNA/mg de tecido): fígado, baço, 6 a 10 mg; rins, 3 a 4 mg; músculo esquelético, cérebro 1 a 1,5 mg; placenta, 1 a 4 mg.
• Rendimento típico de culturas celulares (mg RNA/10⁶ células): células epiteliais, 8 a 15 mg, fibroblastos, 5 a 7 mg.
• A coloração do RNA com brometo de etídio em géis de agarose revela duas bandas predominantes de RNA ribossômico pequeno (2 kb) e grande (5 kb), RNA de massa molecular baixa (0,1 a 0,3 kb) e bandas discretas de RNA de massa molecular alta (7 a 15 kb).

Extração ou isolamento de DNA

1. Com cuidado, remova e descarte a fase aquosa que resta sobre a interfase. Para precipitar o DNA da interfase e da fase orgânica, adicione 0,3 ml de etanol 100% por 1 ml de TRI Reagent usado na etapa 1 do Preparo de amostras. Misture por inversão e deixe as amostras em repouso por 2 a 3 minutos em temperatura ambiente. Centrifugue a 2.000 × g por 5 minutos a uma temperatura de 2 a 8 °C.

Observação: A remoção do restante da fase aquosa antes da precipitação do DNA é uma fase de importância crítica para a qualidade do DNA isolado.

2. Remova o sobrenadante e armazene a uma temperatura de 2 a 8 °C para isolamento de proteínas. Lave o pélete de DNA duas vezes em uma solução de citrato trissódico 0,1 M em etanol 10%. Use 1 ml da solução para cada 1 ml de TRI Reagent usado na etapa 1 do Preparo de amostras. Durante cada lavagem, deixe o pélete DNA em repouso (misturando ocasionalmente) por pelo menos 30 minutos. Centrifugue a 2.000 × g por 5 minutos a uma temperatura de 2 a 8 °C. Ressuspenda o pélete de DNA em etanol 75% (1,5 a 2 ml para cada ml de TRI Reagent) e deixe em repouso por 10 a 20 minutos em temperatura ambiente.

Observação:

• Importante: Não reduza o tempo de permanência das amostras na solução de lavagem. Trinta minutos é o tempo absolutamente mínimo para haver uma remoção eficiente do fenol no DNA.
• Se o pélete tiver > 200 mg de DNA ou grandes quantidades de material que não seja DNA, será necessária uma lavagem adicional em solução de citrato trissódico 0,1 M em etanol 10%.
• As amostras suspensas em etanol 75% podem ser armazenadas a temperaturas de 2 a 8 °C por vários meses.

3. Deixe o pélete de DNA secar por 5 a 10 minutos sob vácuo, e o dissolva em NaOH 8 mM pipetando lenta e repetidamente com uma micropipeta. Adicione uma quantidade suficiente de NaOH 8 mM para obter uma concentração final de DNA de 0,2 a 0,3 mg/ml (geralmente, 0,3 a 0,6 ml para o DNA isolado de cada 50 a 70 mg de tecido ou de 10⁷ células). Essa solução levemente alcalina garante uma dissolução completa do pélete de DNA. Centrifugue a 12.000 × g por 10 minutos para remover qualquer material insolúvel e transfira o sobrenadante para um novo tubo.

Observação:

• Um sobrenadante viscoso indica a presença de DNA com alta massa molecular.
• O tamanho do DNA dependerá da força exercida durante a homogeneização. Evite usar um homogeneizador Polytron.
• As amostras dissolvidas em NaOH 8 mM podem ser armazenadas a temperaturas de 2 a 8 °C de um dia para o outro. Para armazenamento por um período maior, ajuste o pH para um valor entre 7 e 8 e suplemente com EDTA (concentração final de 1 mM).
• Para determinar a concentração de DNA, remova uma alíquota, dilua com água e meça o valor de A260. Para o DNA de fita dupla, 1 unidade/ml de A260 = 50 µg/ml.
• Para calcular o número de células, suponha que a quantidade de DNA para 10⁶ células diploides de humanos, ratos e camundongos seja equivalente a 7,1 µg, 6,5 µg e 5,8 µg, respectivamente.
• Rendimento típico de tecidos (µg DNA/mg tecido): fígado, rins, 3 a 4 µg; músculo esquelético, cérebro e placenta, 2 a 3 µg.
• Rendimento típico de culturas de células humanas, de rato e de camundongo: 5 a 7 µg de DNA/10⁶ células.

Para amplificar o DNA por PCR

Após dissolução em NaOH 8 mM, ajuste o valor do pH para 8,4 usando HEPES (adicione 86 µl de HEPES 0,1 M, ácido livre/ml de solução de DNA). Adicione a amostra (geralmente 0,1 a 1 µg) à mistura de PCR e siga o Protocolo de PCR.

Para digerir o DNA com enzimas de restrição

Ajuste o pH da solução de DNA ao valor necessário para digestão por enzima de restrição usando HEPES, ou faça a diálise das amostras com EDTA 1 mM, em um pH de 7 a 8. Permita que digestão pela enzima de restrição siga por 3 a 24 horas sob condições ótimas. Recomenda-se usar 3 a 5 unidades de enzima para cada 1 µg de DNA. Normalmente, 80 a 90% do DNA é digerido.

Isolamento de proteínas

1. Precipite as proteínas (vide observação) do sobrenadante de fenol-etanol (etapa 2 do Isolamento de DNA) com 1,5 ml de 2-propanol por 1 ml de TRI Reagent usado na etapa 1 do Preparo de amostras. Deixe as amostras em repouso por pelo menos 10 minutos em temperatura ambiente. Centrifugue a 12.000 × g por 10 minutos a uma temperatura de 2 a 8 °C.

Observação: Para algumas amostras, pode ser difícil dissolver o pélete de proteínas em SDS 1% (etapa 3). Use esse procedimento alternativo para corrigir o problema:

• Faça a diálise do sobrenadante de fenol-etanol com 3 trocas de SDS 0,1% a uma temperatura de 2 a 8 °C.
• Centrifugue a 10.000 × g por 10 minutos a uma temperatura de 2 a 8 °C.
• O sobrenadante claro contém proteínas que podem ser usadas em procedimentos de western blot.

2. Descarte o sobrenadante e lave o pélete 3 vezes com uma solução de cloridrato de guanidina 0,3 M em etanol 95%, usando 2 ml para cada 1 ml de TRI Reagent usado na etapa 1 do Preparo de amostras. A cada lavagem, mantenha as amostras na solução de lavagem por 20 minutos em temperatura ambiente. Centrifugue a 7.500 × g por 5 minutos a uma temperatura de 2 a 8 °C. Após 3 lavagens, adicione 2 ml de etanol 100% e agite o pélete de proteínas no vórtex. Deixe as amostras em repouso por pelo menos 20 minutos em temperatura ambiente. Centrifugue a 7.500 × g por 5 minutos a uma temperatura de 2 a 8 °C.

Observação: As amostras de proteínas suspensas em solução de cloridrato de guanidina 0,3 M em etanol 95% ou em etanol 100% podem ser armazenadas por 1 mês a temperaturas de 2 a 8 °C ou por 1 ano a –20 °C.

3. Seque o pélete de proteínas sob vácuo por 5 a 10 minutos. Dissolva o pélete em solução de SDS 1% pressionando repetidamente o êmbolo da micropipeta com a ponteira dentro da solução para ajudar na dissolução. Centrifugue a 10.000 × g por 10 minutos a uma temperatura de 2 a 8 °C para remover qualquer material insolúvel. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. A solução de proteínas deve ser usada imediatamente para western blot ou armazenada a –20 °C.

Guia de solução de problemas

1. Isolamento de RNA:

A. Um rendimento baixo pode ser causado por:

• homogeneização ou lise incompleta das amostras.
• o pélete final de RNA pode não ter sido completamente dissolvido.

B. Se a razão de A260 para A280 for < 1,65:

• a quantidade de amostra utilizada para a homogeneização pode ter sido insuficiente.
• as amostras podem não ter sido deixadas em repouso por 5 minutos em temperatura ambiente após a homogeneização.
• é possível que tenha ocorrido contaminação da fase aquosa pela fase fenólica.
• o pélete final de RNA pode não ter sido completamente dissolvido.

C. Se houver degradação do RNA:

• os tecidos podem não ter sido imediatamente processados ou congelados após terem sido removidos do animal.
• as amostras usadas para o isolamento ou os preparados isolados de RNA podem ter sido armazenadas a –20 °C em vez de a –70 °C, conforme especificado no procedimento.
• as células podem ter sido dispersas por digestão por tripsina.
• pode ser que as soluções aquosas ou os tubos usados para o procedimento não estejam isentos de RNAses.
• é possível que o formaldeído usado para a eletroforese em gel de agarose tivesse um valor de pH < 3,5.

D. Se houver contaminação por DNA:

• o volume de reagente usado para a homogeneização da amostra pode ter sido insuficiente.
• é possível que as amostras usadas para o isolamento contenham solventes orgânicos (etanol, DMSO), tampões fortes ou solução alcalina.

2. Isolamento de DNA:

A. Um rendimento baixo pode ser causado por:

• homogeneização ou lise incompleta das amostras.
• o pélete final de DNA pode não ter sido completamente dissolvido.

B. Se a razão de A260 para A280 for < 1,70:

• pode não ter havido remoção suficiente de fenol do preparado de DNA. Tente lavar o pélete de DNA mais uma vez com a solução de citrato trissódico 0,1 M em etanol 10%.

C. Se houver degradação do DNA:

• os tecidos podem não ter sido imediatamente processados ou congelados após terem sido removidos do animal.
• as amostras usadas para o isolamento podem ter sido armazenadas a –20 °C em vez de a –70 °C, conforme especificado no procedimento.
• as amostras podem ter sido homogeneizadas usando um Polytron ou outro homogeneizador de alta velocidade.

D. Se houver contaminação por RNA:

• pode ter sobrado fase aquosa em excesso junto com a fase orgânica e a interfase.
• o pélete de DNA pode não ter sido lavado suficientemente com a solução de citrato trissódico 0,1 M em etanol 10%.

3. Isolamento de proteínas:

A. Um rendimento baixo pode ser causado por:

• homogeneização ou lise incompleta das amostras.
• o pélete final de proteínas pode não ter sido completamente dissolvido.

B. Se houver degradação das proteínas:

• os tecidos podem não ter sido imediatamente processados ou congelados após terem sido removidos do animal.

C. Se houver deformação das bandas no PAGE:

• o pélete de proteínas pode não ter sido suficientemente lavado.

Anexo

I. Isolamento de RNA Poli A+
Após a precipitação do RNA com 2-propanol (etapa 1 do Isolamento de RNA), dissolva o pélete em tampão de ligação poli A+ e passe através de uma coluna de oligo-dT-celulose para remoção seletiva de mRNA de acordo com o procedimento de Aviv e Leder.³

II. O RNA isolado se destina ao uso em RT-PCR

1. A modificação do procedimento ao implementar a etapa adicional de centrifugação na observação c, da etapa 1B, do Preparo de amostras inicial, minimiza ainda mais a possibilidade de contaminação por DNA no RNA extraído por TRI Reagent LS.

2. Quando as amostras de RNA forem destinadas a uso em RT-PCR, é necessária uma evaporação mais completa do etanol. Isso é especialmente importante para volumes amostrais pequenos (5 a 20 μl), que podem conter um nível relativamente alto de etanol se não forem secas adequadamente.

Referências

1. Chomczynski P. 1993. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15(3):536-7.

2. Chomczynski P, Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162(1):156-159. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90021-2

3. Aviv H, Leder P. 1972. Purification of Biologically Active Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic acid-Cellulose. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69(6):1408-1412. https://doi.org/10.1073/pnas.69.6.1408

4. Chomczynski P, Mackey K. 1995. Substitution of Chloroform by Bromochloropropane in the Single-Step Method of RNA Isolation. Analytical Biochemistry. 225(1):163-164. https://doi.org/10.1006/abio.1995.1126