Introdução à SDS-PAGE - Separação de proteínas com base no tamanho

Os géis de poliacrilamida são formados pela reação de acrilamida e bis-acrilamida (N,N’-metilenobisacrilamida) que resulta em uma matriz de gel altamente reticulada. O gel atua como uma peneira através da qual as proteínas se movem em resposta ao campo elétrico. As proteínas contêm uma carga geral positiva ou negativa; isso permite o movimento de uma molécula de proteína em direção ao ponto isoelétrico no qual a molécula não tem carga líquida. Ao desnaturar as proteínas e dar-lhes uma carga negativa uniforme, é possível separá-las com base no tamanho à medida que migram em direção ao eletrodo positivo.

Figura 1. SDS-PAGE de amostras de proteínas e marcador de proteína color burst(C1992)

Protocolo

Materiais e reagentes necessários

• Câmara de eletroforese vertical com fonte de alimentação, placas de vidro, espaçadores e pentes

Reagentes necessários	Componentes no reagente	Número do produto
Solução de acrilamida/bis-acrilamida	Acrilamida 29,2 g Bis-acrilamida 0,8 g	01696 M7279
Tampões de moldagem de gel	Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 (para preparar gel de resolução): Dissolva 18,15 g de base Tris em 80 ml de água destilada. Ajuste o pH para 8,8 usando HCl 6N. Complete o volume final até 100 ml com água destilada. Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (para preparar gel de empilhamento): Dissolva 6 g de base Tris em 80 ml de água destilada. Ajuste o pH para 6,8 usando HCl 6N. Complete o volume final até 100 ml com água destilada.	93362
Tampão de carregamento 2X Laemmli	Azul de bromofenol 0,004% 2-mercaptoetanol 10% Glicerol 20% SDS 4% Tris-HCl 0,125 M	B5525 M3148 G5516 L3771 93362
Tampão operacional 10X	Tris-HCl 25 mM Glicina 200 mM SDS 0,1% (p/v)	93362 G8898 L3771
10% SDS	SDS	L3771
10% de persulfato de amônio	Persulfato de amônio	A3678
TEMED	TEMED	T9281

OBSERVAÇÃO: A acrilamida e a bisacrilamida são de natureza neurotóxica. Todas as etapas devem ser realizadas com luvas sem talco.

Preparação do gel

• Limpe as placas de vidro e os espaçadores da unidade de moldagem de gel com água deionizada e etanol.
• Monte as placas com os espaçadores sobre uma superfície estável e plana.
• Prepare a solução de gel de resolução usando os seguintes volumes (para 10 ml), dependendo da porcentagem de gel necessária.

Gel %	Água (ml)	30% de acrilamida (ml)	Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 (ml)	10% SDS (µl)	10% APS (µl)	TEMED*(µl)
8%	4,6	2,6	2,6	100	100	10
10%	3,8	3,4	2,6	100	100	10
12%	3,2	4,0	2,6	100	100	10
15%	2,2	5,0	2,6	100	100	10
*TEMED deve ser o último ingrediente adicionado

• Despeje a solução de gel nas placas montadas com espaçadores. Para manter uma superfície de gel de resolução uniforme e horizontal, cubra a superfície com água ou isopropanol (I9516).
  
• Deixe o gel endurecer por cerca de 20-30 minutos em temperatura ambiente.
  
• Prepare a solução de gel de empilhamento usando os seguintes volumes (para 10 ml):
  

Gel %	Água (ml)	30% de acrilamida (ml)	Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (ml)	10% SDS (µl)	10% APS (µl)	TEMED*(µl)
5%	5,86	1,34	2,6	100	100	10

*TEMED deve ser o último ingrediente adicionado

• Descarte a água ou isopropanol sobreposto no gel de resolução
• Adicione a solução de gel de empilhamento a 5% até transbordar. Insira o pente imediatamente garantindo que não haja bolhas de ar presas no gel ou perto dos poços.
• Deixe o gel endurecer por cerca de 20-30 minutos em temperatura ambiente.
  

Preparo de amostras

• Para um volume de amostra de proteína (lisado de células ou tecidos), adicione um volume igual de tampão de carga.
  
• Ferva a mistura acima a 95 °C por 5 min. Centrifugue a 16.000 xg por 5 min.
  
• Estas amostras podem ser armazenadas a -20 °C ou podem ser usadas para prosseguir com eletroforese em gel.

Coloração de gel

Coloração com azul de Coomassie: A coloração de géis de proteína com azul de Coomassie brilhante R-250 é um procedimento comum para visualizar proteínas resolvidas por SDS-PAGE. É altamente sensível e adequado para armazenamento de géis por longo prazo.

Reagentes necessários

• Solução Gel Fix (500 ml)
  
       Metanol (M3641) 250 ml
       Ácido acético glacial (695092) 50 ml
       Água 200 ml
  
  
• Solução Coomassie
  
       CBB R-250 (B6529) 0.1%
       Metanol (M3641) 40%
       Ácido acético glacial (695092) 10%
       Filtre a solução corante usando papel de filtro Whatmann nº 1.
  
  
• Solução de descoloração
  
       Metanol (M3641) 50 ml
       Ácido acético glacial (#695092) 35 ml
  
  
• Solução de armazenamento de gel
  
       Ácido acético glacial (695092) 25 ml
       Água 475 ml

Procedimento

• Após a eletroforese, coloque o gel em uma bandeja plástica contendo solução gel fix. Coloque a bandeja sobre uma mesa oscilante e fixe as proteínas por 2 horas.
  
• Remova a solução de gel fix e adicione a solução de Coomassie.  Coloque sobre uma mesa de balanço e tinja o gel por 2 a 4 horas.
  
• Após a etapa de coloração, lave o gel diversas vezes com água destilada para retirar o excesso de coloração.
  
• Adicione solução descolorante ao gel. Coloque na mesa de balanço e descolora por cerca de 4 horas até que faixas azuis claras no fundo claro fiquem visíveis.
  
• Após a descoloração, os géis podem ser armazenados em solução de armazenamento de gel e fotografados conforme necessário.

Coloração de prata

Oferecemos um kit de coloração de prata para detecção de proteínas altamente sensível, adequado para géis SDS-PAGE. Os seguintes reagentes são adicionalmente necessários:

• Solução de fixação
  
       Etanol (E7023) 50 ml
       Ácido acético 10 ml
       Água 40 ml
  
  
• Solução de etanol a 30% (E7023)

Procedimento

• Após a corrida eletroforética, mergulhe o gel na solução fixadora por 40 min. Uma imersão durante a noite no fixador produzirá um fundo mais claro.
  
• Retire a solução de fixação e lave o gel por 10 min com solução de etanol a 30%, seguido de lavagem com água ultrapura por 10 min.
  
• Decante a água e incube o gel em sensibilizador por 10 min.
  
• Retire o sensibilizador e lave o gel duas vezes com água, cada lavagem com duração de 10 min.
  
• Decante a água e mergulhe o gel durante 10 min em solução de prata.
  
• Decante a solução de prata e lave o gel em água durante 1,5 min.
  
• Descarte a água e mergulhe o gel na solução reveladora por 3 a 7 minutos.
  
• Adicione 5 ml de solução de parada à solução reveladora e incube por 5 min. Remova a solução reveladora/parada e lave o gel em água ultrapura por 15 min.
  
• O gel pode ser fotografado e também armazenado em água doce e ultrapura.

Para coloração dupla, tinja o gel usando CBB R-250, seguido por coloração prata usando os procedimentos acima.

Manchas fluorescentes: Oferecemos corantes fluorescentes SYPRO e Lucy para eletroforese de proteínas. Os géis podem ser imersos na mancha fluorescente no escuro ou o gel pode ser misturado com tampão catódico durante a eletroforese.

Os protocolos de coloração dependerão da coloração utilizada e podem ser encontrados aqui:

• Coloração em gel de proteína Ruby SYPRO^® (PDF)
  
• Solução LUCY^® 506 (PDF)
  

Coloração de gel reversível

As manchas de gel reversíveis permitem ao usuário proceder ao Western blotting de proteínas após o SDS-PAGE.

Coloração R-PROB: R-PROB é um corante exclusivo que detecta proteínas em géis PAGE e Western blots.

Reagentes necessários:

• Kit de detecção de proteínas reversível para membranas e géis de poliacrilamida (RPROB)
  
• Solução de fixação (F7264)
  
• 10% de ácido acético
  
• EDTA de 50 mM

Procedimento

• Mergulhe os géis pós-eletroforese em solução de fixação por 20 minutos. Repita esta etapa duas vezes.
  
• Enxágue o gel em água duas vezes, cada lavagem com duração de 30 minutos.
  
• Incube o gel em solução corante por 20-40 minutos com agitando suavemente.
  
• Lave o excesso de coloração com ácido acético a 10%.
  
• Para descoloração, lave o gel com EDTA seguido de duas lavagens de 15 minutos cada em água ou solução fixadora.

Coloração de cobre: Para confirmar a migração e separação de proteínas, o gel pode ser tingido com um corante reversível como CuCl₂.

Reagentes necessários

• Solução 0,3 M de CuCl₂
  
• Solução 0,25 M Tris e 0,25 M EDTA

Procedimento

• Lave os géis pós-eletroforese em água destilada por no máximo 30 min.
  
• Mergulhe o gel em solução de CuCl₂ 0,3 M por 10 min.
  
• Enxágue com água deionizada.
  
• As proteínas podem ser visualizadas como zonas claras em um fundo azul.
  
• Para descolorir completamente o gel para western blot, lave os géis corados em solução Tris 0,25 M e EDTA 0,25 M, pH 9, repetidamente.
  
• Mova o gel descolorido para o tampão de transferência antes de prosseguir com a configuração da transferência.

Figura 2. Sistema de Blotting e eletroforese vertical

Se desejar fazer a transferência de proteínas para uma membrana após a eletroforese, encontre o protocolo aqui.

Referência

1. Sambrook J, Fritsch T, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.