Dies ist eine der kritischsten Phasen bei der Herstellung von Membranproteinen. In der Solubilisierungsphase werden Membranproteine durch den Einsatz von Detergenzien aus ihrer natürlichen Umgebung, der Lipidmembran, in eine wässrige Umgebung extrahiert. Detergenzien agieren, indem sie die Lipiddoppelschicht auflösen und Lipide und Proteine in Detergenzmizellen einbauen.
Die hydrophoben Oberflächenbereiche der Membranproteine und die Lipidschwänze sind im hydrophoben Inneren der mizellaren Detergenzienstrukturen verborgen, während die hydrophilen Teile der Proteine in Kontakt mit der wässrigen Umgebung stehen (Abb. 1.1). Durch eine gründliche Solubilisierung werden die meisten Lipid-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen aufgelöst und so die Trennung der Proteine ermöglicht.
Das Zielprotein kann in Gegenwart eines Detergenz aufgereinigt werden, wobei im Wesentlichen alle für lösliche Proteine verfügbaren Proteinaufreinigungstechniken angewandt werden können. In einem erfolgreichen Solubilisierungsprotokoll wird das Membranprotein mit hoher Ausbeute extrahiert, es führt zu stabilen Protein-Detergenzien-Komplexen (oder Protein-Lipid-Detergenzien-Komplexen), bei denen das Protein seine aktive Konformation beibehält.
Einige Membranproteine benötigen die Wechselwirkung mit nativen Lipiden aus der Lipiddoppelschicht oder zugesetzten exogenen Lipiden, um in ihrer aktiven Konformation zu bleiben. In solchen Fällen ist es wichtig, dass durch das Solubilisierungsprotokoll die Bildung eines stabilen Protein-Lipid-Detergenzien-Komplexes ermöglicht wird und das/die mit dem Zielprotein verbundene(n) erforderliche(n) native(n) Lipid(e) nicht entfernt wird/werden. Raue Solubilisierungs- und Aufreinigungsverfahren können dazu führen, dass derartige essenzielle Lipide entfernt werden und somit das Protein inaktiviert wird.
Abbildung 1.1.Schematische Darstellung der Detergenziensolubilisierung von Membranproteinen. Membranproteine werden von der natürlichen Lipiddoppelschicht (blau und gelb) in Komplexe mit Detergenz (grün) und in einigen Fällen mit Lipiden überführt. Eine Lipid-Detergenzmizelle, eine Detergenzmizelle und ein freies Detergenz sind ebenfalls dargestellt.
Detergenzien und CMC
Detergenzien sind amphipathische Substanzen mit einer polaren (hydrophilen) Kopfgruppe und einem unpolaren (hydrophoben) Schwanz. Der polare Teil kann nichtionisch, anionisch, kationisch oder zwitterionisch sein und Detergenzien werden oft entsprechend klassifiziert (d. h. ein Detergenz mit einem anionischen polaren Teil wird als anionisches Detergenz bezeichnet). Die Vor- und Nachteile der verschiedenen Detergenzienklassen sind in Tabelle 1.3 aufgeführt.
Detergenzienklasse | Vorteile | Nachteile |
---|---|---|
Nicht-ionisch (z. B. Dodecylmaltosid) | Im Allgemeinen mild und nicht denaturierend. Weitverbreitet | Kann zu geringen Solubilisierungsausbeuten führen |
Ionisch (anionisch oder kationisch) (z. B. SDS, LTAB) | Kann bei der Solubilisierung äußerst effizient sein | Häufig denaturierend. Interferenz mit Ionenaustausch-Trennungen |
Zwitterionisch (z. B. FOS-Cholin 12) | Wird häufig bei der Kristallisation von Membranproteinen verwendet. Kombination der Vorteile ionischer und nicht-ionischer Detergenzien | Stärker denaturierend als nicht-ionische Detergenzien |
Ab einer bestimmten Konzentration in wässriger Umgebung verbinden sich die Detergenzienmoleküle zu multimolekularen Komplexen, den Mizellen, mit hydrophobem Innenteil und hydrophilen Oberflächen. Diese Konzentration wird als kritische Mizellbildungskonzentration (CMC) bezeichnet. Die CMC ist bei verschiedenen Detergenzien unterschiedlich und variiert auch in Abhängigkeit von pH-Wert, Temperatur und Ionenstärke.
Im Allgemeinen sollen alle Puffer und Lösungen, die für die Herstellung von Membranproteinen (zur Solubilisierung, Aufreinigung, Lagerung usw.) verwendet werden, eine Detergenzienkonzentration oberhalb der CMC aufweisen.
In Tabelle 1.4 sind verschiedene Detergenzien aufgeführt, die für die Solubilisierung von Membranproteinen empfohlen werden. Die chemischen Strukturen einiger Beispiel-Detergenzien aus den verschiedenen Klassen sind in Abbildung 1.4 dargestellt.
Detergenz | Klasse1 | FW | CMC2 (mM) |
---|---|---|---|
Brij™ 35 | N | 1200 | 0,07 |
C12E8 | N | 539 | 0,11 |
CHAPS (3[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] propansulfonsäure) | Z | 615 | 8 |
Cymal 7 (Cyclohexyl-n-heptyl- β-D-maltosid) | N | 522 | 0,19 |
Decylmaltosid | N | 483 | 1,8 |
Digitonin | N | 1229 | < 0,5 |
DDM (Dodecylmaltosid) | N | 511 | 0,17 |
FOS-Cholin 12 | Z | 352 | 0,12 |
Hecameg (6-O-(N-Heptylcarbamoyl)methyl- α-D-gluco pyranosid) | N | 335 | 19,5 |
LDAO (Lauryldimethylamin-Oxid) | Z | 229 | 1 |
Nonidet P40 | N | 615 | 0,25 |
Nonylglucosid | N | 306 | 6,5 |
Octylglucosid | N | 292 | 18 |
Tween™ 20 | N | 1228 | 0,06 |
Triton X-100 | N | 647 | 0,23 |
1N = nicht-ionisch; Z = zwitterionisch2
Bei 20 °C bis 25 °C und ~50 mM Na+
Abbildung 1.4.Chemische Strukturen ausgewählter Detergenzien aus den verschiedenen Klassen.
Detergenzien-Screening
Es ist wichtig, mehrere verschiedene Detergenzien und Bedingungen zu testen, um die besten Bedingungen für jedes Membranprotein zu ermitteln. Die Ausbeute der Solubilisierung wird durch einen Test auf das Zielmembranprotein in der solubilisierten Fraktion überwacht. Im nachstehenden Protokoll wird nicht solubilisiertes Material durch Ultrazentrifugation entfernt.
Es ist auch möglich, nicht geklärtes Solubilisat direkt auf speziell entwickelte Chromatographiesäulen oder Multiwell-Platten aufzutragen, die Zelltrümmer verarbeiten können (Performing a small-scale expression screening of histidine-tagged membrane proteins from E. coli lysates) (Durchführung eines Expressionsscreenings von Histidin-markierten Membranproteinen aus E. coli-Lysaten in kleinem Maßstab). Die Filtration kann auch zur Klärung verwendet werden.
Der Proteinnachweis kann mittels Western Blotting nach SDS-PAGE erfolgen. Bei wenig exprimierten Proteinen kann ein chromatographischer Anreicherungsschritt erforderlich sein, bevor ein Proteinnachweis möglich ist (Conditioning) (Konditionierung). Bei stark exprimierten Proteinen kann die Solubilisierungsausbeute durch SDS-PAGE mit Coomassie-Blau-Färbung eingeschätzt werden.
Neben der Bestimmung von Ausbeute und Homogenität ist es oft erforderlich, die Proteinaktivität zu überwachen, welche der beste Hinweis auf eine intakte Proteinstruktur (und -funktion) ist. Bei einigen Membranproteinen können funktionelle Assays auf das durch Detergenzien solubilisierte Protein angewendet werden. In anderen Fällen muss das Membranprotein wieder in eine künstliche Lipiddoppelschicht integriert werden (Rekonstitution des Membranproteins), damit ein funktioneller Assay durchgeführt werden kann.
Allgemeines Verfahren für das Detergenzien-Screening
Pufferherstellung
PBS: 10 mM Phosphat, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,4
Tris-Puffer: 20 mM bei neutralem pH-Wert Tabelle 1.5. Zusätze zum PBS- oder Tris-Puffer für das Detergenzien-Screening
Konzentration des Membranproteins (mg/ml) | Detergenzienkonzentration (%) | NaCl (mM) | Temp. (ºC) | Zeit | |
---|---|---|---|---|---|
Startbedingung | 5 | 1 (immer oberhalb der CMC) | 100 | 4 | 2 h |
Variationsbereich | 1 bis 10 | 0.4 bis 2 (immer oberhalb der CMC) | 100 bis 500 | 4 bis 37 | 5 min - 5 h |
Eine Liste der empfohlenen Detergenzien ist in Tabelle 1.4 enthalten.
Solubilisierung
- Mit der Membranvorbereitung mit bekannter Proteinkonzentration starten und die Materialien, wie in Tabelle 1.5 dargestellt, kombinieren, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erhalten. Unter leichtem Mischen bei der gewünschten Temperatur im angegebenen Zeitraum inkubieren.
- 100.000 × g 45 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Den Überstand auf das Zielprotein überprüfen. Generische einsetzbare Assays sind SDS-PAGE (Performing a purity and homogeneity check) (Durchführung einer Reinheits- und Homogenitätsprüfung), schnelle Affinitätsreinigung mit anschließender Gelfiltration (Performing a purity and homogeneity check) und Affinitäts-Tag-spezifische Assays (z. B. ein Dot-Blot mit Tag-spezifischen Antikörpern). Es ist wichtig, auch Assays für die Aktivität von Membranproteinen in Betracht zu ziehen.
Das Expressionsscreening-Protokoll in Performing a small-scale expression screening of histidine-tagged membrane proteins from E. coli lysates (Durchführung eines Expressionsscreenings von Histidin-markierten Membranproteinen aus E. coli-Lysaten in kleinem Maßstab) kann an ein kombiniertes Solubilisierungs- und Bindungsscreening-Protokoll angepasst werden.
Die Ergebnisse eines vorläufigen Solubilisierungsscreenings von EM29, einem Mr 29 000 Histidin-markierten Membranprotein aus E. coli, sind in Abbildung 1.5 dargestellt. Eine starke Bande an der für das Zielprotein erwarteten Position deutet auf eine hohe Expression und/oder eine effiziente Solubilisierung hin. FC12, Triton X-100 und LDAO ergaben schwächere Banden als die anderen getesteten Detergenzien. Daraus wurde geschlossen, dass diese Detergenzien für die Solubilisierung dieses Proteins weniger geeignet sind. Es ist wichtig, auch darauf hinzuweisen, dass eine hohe oder angemessene Ausbeute mit der Erhaltung der Aktivität und der Stabilität in der Detergenzienlösung nach der Solubilisierung kombiniert werden muss – dies ist die nächste Screening-Analyse, die in Betracht zu ziehen ist.
Abbildung 1.5.Analyse durch SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung eines kombinierten Expressionsscreenings und eines vorläufigen Solubilisierungsscreenings von EM29. Es wurden acht verschiedene Detergenzien getestet und die Elution erfolgte in zwei Schritten (linke bzw. rechte Hälfte des Gels). FC12 = FOS-Cholin 12; UDM = Undecyl-Maltosid; DDM = Dodecyl-Maltosid; OG = Octyl-Glucosid; TX-100 = Triton X-100; LDAO = Lauryl-Dimethylamin-Oxid. Die Daten wurden freundlicherweise von Dr. Said Eshaghi vom Karolinska Institutet in Stockholm, Schweden, zur Verfügung gestellt.
Bestimmte Lipide können mit dem Protein in der nativen Membran assoziiert und ihre Gegenwart für die Proteinaktivität maßgeblich sein. Damit die Aktivität erhalten bleibt, müssen diese Lipide nach Solubilisierung und Reinigung immer noch vorhanden sein. Raue Solubilisierungs- und Aufreinigungsbedingungen können zur Entfernung dieser Lipide führen, woraus eine Inaktivierung des Membranproteins resultiert.
DDM ist oft ein gut geeignetes Detergenz für erste Solubilisierungsversuche.
CHAPS und Digitonin haben sich als besonders geeignet für die Solubilisierung von Membranproteinen aus Pichia pastoris erwiesen.
Solubilisierungsscreening für in E. coli hergestellte GST-markierte Membranproteine
Das nachstehend beschriebene Verfahren (Abbildung 1.6) bietet eine einfache und schnelle Methode für die Auswahl optimaler Solubilisierungsbedingungen, um eine möglichst hohe Ausbeute GST-markierter Membranproteine zu erhalten. Dieses Screening-Verfahren basiert auf der Affinität von GST zu Glutathion-Sepharose-4B-Medien. Die für das Screening ausgewählten Detergenzien dürfen die GST-Bindungsaktivität nicht beeinträchtigen.
Abbildung 1.6.Detergenzien-Screening-Assay für ein GST-markiertes Membranprotein.
Materialien
GST-Nachweismodul
GST SpinTrapTM Aufreinigungsmodul
GST MultiTrap 4B
Bindepuffer: 10 mM Phosphat, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,4 (PBS)
Elutionspuffer: Bindepuffer, ergänzt mit 0,2 % (w/v) Detergenz und 10 mM reduziertem Glutathion
Solubilisierungs-Screening
Wenn die enzymatische Aktivität von GST (als Indikator für die GST-Bindungsaktivität) in Gegenwart der ausgewählten Detergenzien nicht bekannt ist, ist die GST-Aktivität in den Detergenzien mit dem CDNB-Assay des GST-Nachweismoduls zu bewerten. Vergleich der GST-Aktivität in Gegenwart und Abwesenheit der einzelnen Detergenzien. Es ist bekannt, dass GST in DDM, CHAPS, Octylglucosid, Tween 20, Triton X-100, Brij35 und NP 40 bei Detergenzienkonzentrationen zwischen dem 0,3- bis 10-fachen der CMC für jedes Detergenz vollständig aktiv ist.
- Zellen durch Lysozym-Behandlung in Kombination mit Gefrieren/Auftauen aufschließen und Membranen durch Zentrifugation bei ~50.000 × g für 30 Minuten bei 4 °C isolieren (siehe "Membranpräparation aus E. coli" in Performing a cell disruption and membrane preparation (Durchführung eines Zellaufschluss und einer Membranpräparation)). Es können höhere Geschwindigkeiten und längere Zentrifugationszeiten (z. B. 100.000 × g für 60 Minuten) erforderlich sein, wenn rauere Zellaufschlussverfahren eingesetzt werden.
- Das Membranplättchen (1:10 w/v) in 5 % (w/v) Detergenzlösungen 2 Stunden auf Eis unter leichtem Schütteln solubilisieren (weitere Informationen unter "Detergenzien-Screening" weiter oben).
- Klären durch Zentrifugation bei ~50.000 × g für 30 Minuten bei 4 °C (oder bei 18.000 × g für 60 Minuten bei 4 °C).
- 500 µl des Überstands dekantieren und mit dem GST-SpinTrap-Aufreinigungsmodul oder GST MultiTrap 4B gemäß den mitgelieferten Anweisungen aufreinigen. Mit 500 µl Elutionspuffer eluieren. Test auf GST-Aktivität mit dem GST-Nachweismodul.
- Mittels SDS-PAGE analysieren (siehe Durchführung einer Reinheits- und Homogenitätsprüfung).
Optimierung der Solubilisierungsbedingungen
Nach Festlegung der Ausgangsbedingungen für die Solubilisierung können die Bedingungen durch weiteres Screening eines oder einer begrenzten Anzahl Detergenzien optimiert werden. Nützliche zu untersuchende Screening-Parameter sind:
- Verhältnis von Proteinkonzentration und Detergenzienkonzentration. Typisch sind Proteinkonzentrationen im Bereich von 1 bis 10 mg/ml
- Solubilisierungszeit und Mischbedingungen (z. B. leichtes Schütteln, End-over-End-Rotation oder kräftiges Rühren)
- pH-Wert
- Ionenstärke
Die Größenhomogenität kann als Indikator für die Stabilität (und damit für optimale Solubilisierungsbedingungen) verwendet werden, da Membranproteine oft oligomerisieren oder schnell aggregieren, wenn sie destabilisiert werden. Die Größenhomogenität kann in kurzer Zeit mit SuperdexTM 200 5/150 GL bewertet werden (siehe "Charakterisierung der Größenhomogenität" in Durchführung einer Reinheits- und Homogenitätsprüfung). In Abbildung 1.7 wird dargestellt, wie SuperdexTM 200 5/150 GL (Säulenvolumen 3 ml) für das Homogenitätsscreening unter verschiedenen pH- und Salzbedingungen verwendet werden kann.
Abbildung 1.7.Screening von pH- und Ionenstärkebedingungen für optimale Homogenität und Stabilität eines Detergenz-Protein-Komplexes. Die schnelle Gelfiltration mit Superdex 200 5/150 GL wies einen symmetrischen Peak auf, wenn die Trennung bei einem pH-Wert von 5,2 in 0,1 M NaCl (A) durchgeführt wurde, was unter diesen Bedingungen auf ein homogenes Protein hinweist. Bei einer etwas höheren Salzkonzentration (D) trat ein kleiner Peak in der Nähe des Totvolumens auf, was darauf hindeutet, dass Oligomerisierung oder Aggregation in begrenztem Umfang auftraten. Sowohl bei einem pH-Wert von 7,5 als auch 9,5 traten signifikante Peaks in der Nähe des Totvolumens auf, was auf eine starke Oligomerisierung oder Aggregation hinweist. Das gesamte Screening-Verfahren wurde in nur wenigen Stunden, einschließlich der Zeit für die Säulenäquilibrierung, durchgeführt. Der Probenverbrauch betrug 6 × 10 µl für das gesamte Screening. Die Daten wurden freundlicherweise von Dr. Said Eshagi vom Karolinska Institutet in Stockholm, Schweden, zur Verfügung gestellt.
Es können auch Detergenziengemische in Betracht gezogen werden.
Es kann nützlich sein, Zusatzstoffe wie Lipide und kleine Amphiphile (z. B. 1,2,3-Heptantriol) oder bekannte Liganden für das Zielprotein zu testen. Kleine Amphiphile können das Kristallisationsverhalten beeinflussen, indem sie die Größe der Detergenzmizellen verändern. Es wird angenommen, dass Liganden die Dynamik der Proteinstruktur verringern und somit das Protein in Detergenzienlösungen stabilisieren.
Solubilisierung für die Aufreinigung
Nach der Optimierung wird das Solubilisierungsprotokoll in einem Maßstab durchgeführt, der für die zu gewinnende Membranproteinmenge geeignet ist.
Es wird empfohlen, unmittelbar nach der Solubilisierung mit der Aufreinigung fortzufahren, um den Verlust der Membranproteinaktivität durch Aggregation, Strukturverlust oder Proteolyse zu minimieren.
Ein Detergenz, das sich gut für die Solubilisierung eines bestimmten Membranproteins eignet, kann für andere Vorgänge mit dem gleichen Protein (z. B. Kristallisierung) weniger geeignet sein. Die Verfahren für den Austausch von Detergenzien werden unter Konditionierung beschrieben.
Solubilisierung mit organischen Lösungsmitteln
Kleine und stabile Membranproteine lassen sich in einigen Fällen mittels organischer Lösungsmittel in ihrer aktiven Form aus der Lipiddoppelschicht extrahieren. So wurde beispielsweise ein 110 Aminosäuren umfassendes Membranprotein aus E. coli mit einem Chloroform-Methanol-Gemisch extrahiert und die erste Aufreinigung des Extrakts erfolgte in dieser Umgebung mit einem Chromatographiemedium und einer Säule, die resistent gegen organische Lösungsmittel sind (Abbildung 1.8; 13). Für dieses Membranprotein ergab ein 1:1-Verhältnis von Chloroform zu Methanol die beste Trennung.
Abbildung 1.8.Trennung von Lösungsmittel-extrahierten Membranproteinen durch Gelfiltration. Durchgehende Linie = organischer Extrakt von E. coli-Membranen, in denen EmrE (ein mehrfach arzneimittelresistentes Transporterprotein) überexprimiert wurde; gestrichelte Linie = organischer Extrakt von "leeren" E. coli-Membranen. Es wurden zwei Verhältnisse von Chloroform (C) und Methanol (M) verwendet. Mit dem Sternchen sind EmrE-haltige Peaks markiert. Mit Genehmigung verwendet. Copyright 2002 Elsevier Science (USA) Publication.
Abbildung 1.13.Charakterisierung der Größenhomogenität von Membranproteinen durch Gelfiltration. Die IMAC-Aufreinigungen von drei E. coli-Membranproteinen wurden durch Gelfiltration mittels Superdex 200 analysiert. Jedes Protein wurde separat durch IMAC in Gegenwart zweier verschiedener Detergenzien aufgereinigt. Die Gel-Filtrationsanalyse wurde mit dem gleichen Detergenz durchgeführt, das auch für die Aufreinigung verwendet wurde. Ein symmetrischer Peak (der nicht am Totvolumen liegt), wie in Chromatogramm C, macht deutlich, dass das Protein nicht aggregiert ist, was auf eine erfolgreiche Reinigung hinweist. Blaue Linie = A280-Kurve. Mit Genehmigung verwendet. Copyright 2005 The Protein Society.
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