Anti-FLAG® M2磁珠用於FLAG® Tag 蛋白擷取
Anti-FLAG® ；M2 磁珠提供簡易、快速、方便的方法來檢測和擷取具有 FLAG® 肽序列的融合蛋白。珠子由鼠源抗FLAG® 克隆 M2 單克隆抗體附著在超順磁鐵浸漬的 4% 琼脂糖珠子上組成。抗FLAG® M2抗體可辨識在哺乳動物和細菌細胞中表達的融合蛋白的N-端、Met-N-端或C-端位置的FLAG® 八肽序列（N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Lys-C）。
使用抗FLAG® M2磁珠時，融合蛋白的洗脱有不同的選擇，其中包括肽競爭、低pH值和SDS-PAGE樣品緩衝液。在此，我們比較了對照融合蛋白 N-端 Met-3XFLAG®-BAP (P7582）或 C 端 FLAG®-BAP（P7457）單獨孵育或加入 A431 細胞裂解液中。
通過與 3X FLAG® 肽 (F4799)以及酸性 pH (2.5-3.0）為 Anti-FLAG® M2 磁珠提供了最有效的洗脫條件。用 3X FLAG® 肽洗脱时，样品需要用 100-150 ng/µL FLAG 肽溶液孵育 30 分钟，而用 pH 洗脱时，样品需要用 0.1 M Glycine HCl pH 2.5-3.0 孵育不到 10 分钟。我們也證實了用高 pH (8-10) 來洗脫這種珠子是不夠的，而且用甘氨酸 HCl 延長孵育時間也不會增加洗脫的蛋白質量。最後，我們也比較了使用 SDS-PAGE 樣品緩衝液洗脫的樣品。這種洗脫條件很簡單，但由於 M2 抗體會因為上載緩衝液中 SDS 的存在而變性，因此凝膠電泳的分析結果顯示出與抗FLAG® antibody 的重鏈和輕鏈相對應的條帶。
樣品製備與親和純化
Anti-FLAG® ；M2 磁珠（M8823）徹底重懸，將 20 µL 懸浮液（包括 10 µL 包裝樹脂）等分到幾個 1.5 mL 微離心管中。試管放入 PureProteome™ 磁架 (LSKMAGS08)，待所有珠子遷移到磁鐵上後，取出並棄掉上清液。加入 200 µL Tris Buffer Saline (TBS)平衡樹脂，然後進行樣品孵育（圖 1）。
圖 1.抗FLAG® M2 磁珠使用三種洗脫方法進行小規模免疫沉淀的方案。
將C-端FLAG-BAP™融合蛋白或N-端FLAG-BAP™融合蛋白稀釋至0.6 ng/µL的最終濃度（500 µL樣品中加入300 ng蛋白）來製備樣品。FLAG-BAP™ 融合蛋白也以相同的最終濃度加入 A431 細胞裂解液中，稀釋至蛋白裂解液總濃度為 1.6 ng/µL。為了保持珠子懸浮並與 500 µL 的樣品接觸，試管使用端面轉盤培養 3 小時至過夜。培養結束後，將所有試管放入磁鐵架，移去上清液，再以 500 µL TBS 洗滌三次。使用三種方法洗脫蛋白質：
- 使用 3X FLAG® 多肽的競爭洗脫是在室溫下進行的，使用軌道振動器將珠與 50 µL 100 ng/µL 多肽溶液孵育 30 分鐘。
- 對於用 SDS-PAGE 樣品緩衝液洗脫的樣品，加入 20 µL 2X Laemmli 樣品緩衝液（不含 DTT），試管在 95°C 下煮沸 10 分鐘，然後上膠。
- 在室溫下以 pH 值進行洗脱，方法是將珠子與 50 µL 甘氨酸 HCl（pH 值為 2.5-3.0）或甘氨酸 NaOH（pH 值為 8.0 - 10）。
培養後，將所有試管放入磁力架，並將上清液（洗出部分）轉移至乾淨的微離心管。加入 10 µL 0.5 M Tris、1.5 M NaCl pH 8.0 溶液，立即中和低 pH 值洗脱的樣品。
Electrophoresis和Western Blotting
使用4-12% SDS-PAGE凝膠分離樣本，在200伏特下運行30分鐘。凝膠用Coomassie染色或轉移到Immobilon®-P PVDF膜上。轉移後，用 2% 非脂乾牛奶 (NFDM) 阻斷印記 1 小時，接著用阻斷緩衝液稀釋 1:1000 的抗FLAG® M2 抗體 (F3165)孵育 1 小時。印片在 TBS-T 中洗三次，用稀釋為 1:50,000 的山羊抗小鼠 IgG HRP (AP124P)孵育 1 小時。
為了進行檢測，所有印跡均用 Immobilon® Forte Western HRP 底物孵育 5 分鐘，並使用數位成像系統獲取圖像。
FLAG-tagged融合蛋白的洗脱技术比较
两个对照融合蛋白，N-末端FLAG-BAP™和C-末端FLAG-BAP™。和C-末端FLAG-BAP™，以及添加了N-末端FLAG-BAP™的A431細胞裂解液，與抗FLAG® M2磁珠孵育，並使用三種不同的洗脫方法進行洗脫。圖 2 顯示，使用這三種方法都能有效地洗脫蛋白質，當使用 SDS 負載緩衝液作為洗脫液時，可以看到與 anti-FLAG® M2 抗體的重鏈和輕鏈相對應的額外條帶。
圖 2.抗FLAG® M2磁珠所用的三種洗脫方法比較。St=起始材料；3X=3X FLAG®肽，pH=2.5甘氨酸
用Glycine HCl（pH 2.5-3.0）和Glycine NaOH（pH 8-10.6）溶液洗脱8個含有加有N-端FLAG-BAP™對照蛋白的A431細胞裂解物樣本。洗離的餾分經電泳分離後電印跡。結果顯示抗FLAG® M2磁珠只能在酸性條件下被洗脫（圖3）。
圖 3.與使用 3X FLAG® 多肽的洗脫相比，pH 值範圍較廣 (2.5 至 10.6)。左圖：Coomassie染色凝膠。右圖：抗 FLAG® M2 抗體的免疫印圖。
為了證明pH洗脫不需要與珠子孵育10分鐘以上，使用0.1 M甘氨酸鹽酸pH 2.5、2.8和3.0對不同的樣品進行了不同的孵育時間。 圖4 表明產率與孵育時間無關，與3X-FLAG肽競爭洗脫相似。
圖 4.甘氨酸孵育 5 至 30 分鐘後洗脫餾分的比較。左圖：Coomassie染色凝膠。右圖：抗FLAG® M2 抗體的免疫印圖。
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