鹽
在 HIC 中，結合過程比洗脫過程更具選擇性，因此優化起始緩衝液的條件至關重要。正確選擇鹽和鹽濃度是影響容量和最終選擇性的最重要參數。目的是優化條件，以達到結合目標蛋白所需的選擇性，並確保絕大多數的雜質通過色譜柱。
不同鹽對疏水作用的影響在第 1 章中有說明。實際上，硫酸鈉、硫酸鉀或硫酸銨能有效促進 HIC 中配體與蛋白質之間的互動，並對蛋白質結構產生穩定的影響。因此，最常使用的鹽類為 (NH4)2SO42SO4、NaCl、KCl 和 CH3COONH4。圖 1 展示了不同鹽分如何影響選擇性的範例。在此，在起始緩衝液中使用 1.7 M 硫酸銨可獲得四種標準蛋白的最佳解析度。
圖 1. 不同的鹽會影響選擇性：洗脫量依序增加：細胞色素 C、溶菌酶、核糖核酸酶 A、α-胸腺胰蛋白酶原。
與培養基的選擇一樣，用於 HIC 分離的鹽的選擇也是一個需要不斷嘗試的問題，因為每種鹽在促進疏水相互作用的能力上都有所不同。
- 與其他鹽相比，硫酸銨在特定濃度下的解析度最好，濃度可達 2 M。
- 使用氯化鈉時，通常需要高達 3 M 的濃度。
- 硫酸鈉是非常好的除鹽劑，但蛋白質溶解度的問題可能會排除它在高濃度下的使用。
- 不建議在 pH 值高於 8.0 的環境下使用硫酸銨。
圖 2. 起始緩衝液中的鹽濃度會影響選擇性和解析度。
圖 2 顯示鹽濃度對選擇性和解析度的影響。在這個例子中，目標蛋白是最後一個洗脫的峰。介質的選擇性令人滿意，因為蛋白質在梯度內洗脫，並與雜質很好地分離。在(a)中，目標蛋白質在陡峭的區域洗脫，但在梯度的後期。降低初始鹽濃度(b)可得到類似的解析度，但可確保在早期運行（使用較高鹽濃度時）結合的雜質現在會在初始洗滌步驟中洗出。只有目標蛋白質會被結合，降低了污染物與目標蛋白質共同結合的風險，並增加了色譜柱對目標蛋白質的處理能力。在更低的初始鹽濃度(c)下進行的運行顯示出良好的選擇性，但對目標蛋白質的效率很低。
- 如果目标分子洗脱太迟或根本没有洗脱，而切换到不同的介质又不可能，可以尝试在盐浓度降低50%的情况下进行结合。
- 有些蛋白质在高盐浓度下开始沉淀。可能需要降低起始緩衝液中的鹽濃度，以防止在運行過程中出現沉澱。少量重複載入樣品也有助於避免因沉澱造成的產率損失。
緩衝離子與 pH 值
緩衝離子的選擇對疏水作用而言並非關鍵。磷酸盐缓冲液是最常用的。
选择的 pH 值必须与蛋白质的稳定性和活性相适应，建议检查每个特定应用的最佳 pH 条件。然而，在 pH 5-8.5 之間，pH 值對於 HIC 分離的最終選擇性和解析度意義不大。pH 值的增加會減弱疏水作用，在 pH 值高於 8.5 或低於 5.0 時，蛋白質的保留會發生更大的變化。
- 檢查在分離過程中使用的 pH 值和鹽濃度下的穩定性，特別是如果生物活性的恢復是一個優先考量。避免 pH 或其他可能導致失活甚至沉澱的條件發生劇烈變化。
- 使用的緩衝液濃度，通常為 20-50 mM，足以在樣品應用和鹽濃度變化期間維持緩衝能力和 pH。
- 如果產品需要凍乾，請將純化的蛋白質轉移至揮發性緩衝液中。 表 3 列出適合的揮發性緩衝液系統。
- 在使用時的相同溫度下準備緩衝液，以確保 pH 值正確。
- 在加入所有鹽分和添加劑後，過濾緩衝液和樣品。使用高品質的水和化學品。對於顆粒大小高於 90 μm 的培養基，請使用 1 μm 過濾器；對於 34 μm 的顆粒，請使用 0.45 μm 過濾器；對於 15 μm 以下的顆粒，或需要無菌或特別乾淨的樣品時，請使用 0.22 μm 過濾器。
- 對於疏水性未知的樣品，請嘗試以下方法：
起始緩衝液：1.5 M 硫酸铵，50 mM 磷酸钠，pH 7.0
洗脱缓冲液：50 mM 磷酸钠，pH 7.0
缓冲液添加剂
添加剂可用于提高选择性和分辨率，例如，当蛋白质与 HIC 培养基结合太强时。但是，如果使用高濃度的添加劑，就有可能使目標蛋白失活和/或變性。添加劑可改善蛋白質的溶解度、改變蛋白質的構象及促進結合蛋白質的洗脫，從而影響分離。水溶性醇類、洗滌劑和混沌鹽（使用有限）是 HIC 分離中最廣泛使用的添加劑。典型的添加劑如表 4.
所示。運行包含添加劑的空白洗脫梯度，以檢查其對洗脫剖面的影響（即執行運行但不載入任何樣品）。
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