開始使用 MISSION^® shRNA

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為什麼選擇 shRNA？
使用控制
從細菌甘油庫存開始
以純化的質粒 DNA 開始
開始使用慢病毒轉導粒子
首次訂購
RNAi 詞彙
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Why Choose shRNA?

使用 RNA 干擾進行基因沉默和基因敲除已逐漸成為常規。將小幹擾 RNA（siRNA）導入培養細胞提供了快速有效的基因表達敲除方法，也讓 siRNA 快速成為分子生物學中無所不在的工具。siRNA 已被證實對某些轉化的哺乳類動物細胞株的短期基因抑制有效，而 shRNA 則提供了一個有效且穩定地抑制基因表達的機會。

長期、穩定的基因沉默使短髮夾 RNA 建構物 (shRNA) 有別於其他 RNAi 工具。對於轉換速度較慢或可能轉換速度較慢的基因來說，利用 shRNA 長期沉默不只是方便，而是唯一的選擇。對於這些蛋白質，siRNA 可能會在細胞有效降解 mRNA 之前被稀釋掉。長期基因沉默可透過標準的克隆選擇方法達成，使用 pLKO.1 質粒，然後再進行嘌呤霉素選擇。MISSION^® bioproduction 團隊可以為您提供遠比克隆選擇更有效、更不偏頗的解決方案--慢病毒遞送 shRNA MISSION^® TRC (什麼是 TRC?)的 shRNA 慢病毒建構物能夠輕易地轉導典型的困難細胞株，例如原代細胞和非分裂細胞，並輕易地將 shRNA 整合到這些細胞的基因組中，以達到穩定的基因沉默。

我們提供保證 當您購買 shRNA 詳細頁面上所定義的克隆集數量時，針對您感興趣的基因（這會有所不同，但通常是 5 個克隆），其中至少有一個基因的克隆應該產生超過 70% 的基因敲除。

檢視 應用資料 來自我們的研發團隊以及獨立研究者。

使用对照

在使用 MISSION^® TRC shRNA 建構物進行實驗時，適當的對照應該是您的實驗設計的關鍵元素，以便準確解釋基因敲除結果。所有的對照都有純化質粒 DNA 和慢病毒粒子兩種格式。

此外，MISSION^® TurboGFP™ Control Transduction Particles (SHC003V)可在首次使用細胞系時用於優化轉導效率。

我們為任何 shRNA 實驗所推薦的控制方法都在 shRNA 控制方法網頁中提供，並與 Nature Cell Biology 社論中所建議的控制方法緊密結合。

參考資料：

1. Whither RNAi? Nature Cell Biology. 5(2003):489-490.

MISSION^® TRC shRNA 細菌甘油庫存提供了可再生的資源。從細菌甘油庫存開始

MISSION^® TRC shRNA 細菌甘油庫存為 shRNA 建構提供了可再生的資源。這些載體可直接用於瞬間或穩定的轉染，或與包裝質粒一起用於生產慢病毒轉導顆粒。

請瀏覽Vector map網站

MISSION^® SHRNA 細菌甘油庫存技術公告 (PDF)

疑難排解：

問題	原因	解決方法
選擇平板上無細菌培養物生長	羧苄青霉素濃度不正確	重新檢查羧苄青霉素濃度或倒入含 100 µg/mL 羧苄青霉素的新平板。
	冷凍培養物接種量不足	從冷凍甘油中取出較大量的培養物。
	冷凍培養物的儲存溫度不足	儲存溫度必須為 -70 °C 或更低。
	多次冻融循环	避免将培养物冻融超过 2 次。
質粒產量低	困難的建構	對產量低的建構進行較大的純化（midi 或 maxi 預製）。
	未能使用單一菌落接種	使用分離的菌落接種培養物進行 DNA 預製。

以純化的質粒 DNA 開始

MISSION^® TRC shRNA 純化的質粒 DNA 格式省去了從每個建構物中製備 DNA 的麻煩。DNA 可直接用於瞬間或穩定轉染，或與包裝質粒一起在包裝細胞系中產生慢病毒粒子。

請參閱 Vector map website

MISSION^® shRNA質粒DNA技術公告 (PDF)

MISSION^® TRC shRNA純化質粒 DNA 構建物與大多數市售的轉染試劑相容。某些細胞系可能比其他細胞系對轉染更敏感/更耐受。轉染效率可使用 MISSION^® TurboGFP Control Vector (SHC003)進行優化。

我們提供多種轉染試劑 ，涵蓋許多細胞類型。

從慢病毒轉導粒子開始

MISSION^® TRC shRNA 慢病毒轉導顆粒格式提供了極致的便利性。轉導粒子可直接加入您的細胞中。

高通量慢病毒粒子生產結果

MISSION^®shRNA慢病毒轉导粒子技術公告 (PDF) 

選擇您的細胞株

MISSION^® TRC 慢病毒粒子是用 VSV-G 包膜蛋白假型的。這可讓含有 shRNA 的慢病毒粒子有效轉導至大多數哺乳類動物細胞系。建議第一次使用某個細胞株時，使用 MISSION^® TurboGFP Control Transduction Particles (SHC003V)來優化轉導所需的慢病毒粒子數量。此重要的陽性對照可表達綠色螢光蛋白標記 TurboGFP，可用於監控實驗設計並協助詮釋結果。使用 ExpressMag^®轉導系統可進一步增強轉導效果。

Has your cell line been validated for lentiviral transduction?

選擇您的檢驗方法

確定您要執行的檢驗方法以評估目標基因的表達和基因敲除是非常重要的。有多種檢測方法可用於確定 mRNA 轉錄物水平、蛋白水平或表型反應。在決定您的檢驗方法時，請記住敲除重要基因可能會對您的細胞造成致命的影響，並影響您所執行的檢驗類型。

mRNA 轉錄分析

蛋白質分析
Western Blotting

表型分析
癌症指標
細胞活力與增殖 細胞訊號

感染多倍性 (MOI)

感染多倍性是指每個細胞轉導慢病毒粒子的數量。我們強烈建議，對於要轉導的每一種新細胞類型，都要測試一定範圍的 MOI。可透過增加/減少每孔的細胞數量或增加/減少加入孔中的上清液數量來調整 MOI。這將決定高效率轉導各細胞系所需的最佳慢病毒上清量。我們建議測試 0.5、1、2 和 5 的 MOI。

計算方法：

（每孔細胞總數）x（期望的 MOI）= 所需的總轉導單位 (TU)

(Total TU needed) / (TU/mL reported on C of A) = Total mL of lentiviral particles to add to each well

Puromycin滴定（使用選擇時）

使用新的細胞類型時，應執行Puromycin滴定（殺死曲線）。

1. 將 1.6 x 10⁴ 細胞放入 96 孔板的孔中，並加入 120 µL 新鮮培養基。
2. 第二天在選定的孔中加入 500-10,000 ng/mL 的嘌呤霉素。
3. 每 2 天檢查一次存活率。
4. 培養 10-14 天，每 3 天更換一次含有嘌呤霉素的培養基。
5. 對於該類型細胞，應使用能在 3-5 天後導致細胞完全死亡的最低嘌呤霉素濃度。

我們在 protocols website.

首次訂購

MISSION^® TRC shRNA 文庫可供線上訂購。您必須先建立您的線上檔案，並勾選表格上的 "request web ordering access" 方塊。一旦您的個人資料建立完成並通過審核，您就可以將克隆加入訂購車。

更多幫助

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