生物發光螢光素酶測試

什麼是萤火虫荧光素酶？

萤火虫荧光素酶是一种广泛用于研究基因调控和功能的生物发光报告物。由於在 哺乳類細胞 或組織中沒有內源螢光素酶活性，因此它是一種非常敏感的基因報告器。萤火虫荧光素酶是一种 62,000 道尔顿的蛋白质，它以单体形式具有活性，不需要后续加工就能发挥其活性。這種酵素催化 ATP 依賴的 D-luciferin 氧化為 oxyluciferin，產生以 560 nm 為中心的光發射光。反應所發出的光與螢光素酶分子的數量成正比。

圖 1. 螢光素分析原理。萤火虫荧光素酶催化的生物发光反应产生光。

生物發光與螢光有何差異？

生物發光是一種化學過程，在此過程中酶會分解底物（如螢光素酶和 D-螢光素），而此反應的副產品之一就是光。生物發光自然存在於自然界中的各種藻類、細菌、真菌和一些水生動物，例如水母。螢光是一個物理過程，光將螢光體中的電子激發到較高的能量狀態，當電子回落到基態時，就會發射出一個光子。

螢光素分析如何進行？

螢光素酶測試（SCT151, ；SCT154, LUC1、 LUCASSY-RO)是專為簡單有效地定量培養細胞中螢火蟲螢光素酶報告酶活性而設計的，具有高靈敏度和線性。這是一種閃光型發光檢測，需要在向樣品中加入工作溶液後立即測量信號。

由螢光素酶反應產生的光導致在酶表面形成自殺腺苷-氧螢光素。

螢光素脢反應所產生的光，會在酵素表面形成自殺性的腺苷-氧-螢光素，因此光發射的半衰期非常短，具有閃光型動力學。Firefly Luciferase HTS Assay (SCT150)使用專利的混合物質設計，這些物質可改變酵素反應，藉由防止腺苷-oxy-luciferin在酵素表面形成，產生長效訊號（穩定光輝）。它是一種均一的高靈敏度螢光素酶報告基因檢測試劑盒，用於定量檢測哺乳動物細胞中螢光素酶的表達，信號半衰期約為 3 小時（圖 2）。與閃光型檢測相比，輝光型螢光素酶檢測的發光信號較低。檢測的靈敏度和檢測限取決於您實驗系統中的螢光素酶表達水平以及發光儀的靈敏度。

圖 2. 在萤火虫荧光素酶测定中滴定重组萤火虫荧光素酶。A) 在含有 1 Mg/mL BSA 的 1X 萤火虫裂解缓冲液中对重组荧光素酶进行序列稀释，并在测定中进行测定。B) 萤火虫荧光素酶 HTS 检测试剂盒是一种稳辉高灵敏度萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒，用于定量检测哺乳动物细胞中萤火虫荧光素酶的表达，信号半衰期约为 3 小时。

萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和萤火虫荧光素酶（Renilla luciferase）的区别是什么？

萤火虫荧光素酶测定使用荧光素在氧气、ATP和镁的存在下产生光（绿色/黄色，550-70 nM），而 ；Renilla luciferase assays (SCT153)只需要鈷胺和氧就能產生光（藍色，480 nM）。 Renilla 螢光素酶已被用作研究基因調控和功能的報告基因 體外 和 體內。它通常用於多重轉錄報告分析，或作為螢火蟲螢光素酶分析的正常化轉染對照。該酶的活性不需要轉譯後修飾，可在轉譯後立即發揮基因報告器的功能。Coelenterazine，Renilla 螢光素脢的底物，也會因不依靠酵素的氧化作用而發光，這個過程稱為自發光。細胞和組織中的超氧陰離子和過氧亞硝酸鹽會增強自發光。

圖 3. 萤火虫荧光素酶与雷尼拉荧光素酶。萤火虫荧光素酶和雷尼拉荧光素酶催化的生物发光反应。

雙荧光素酶测定的优势是什么？

Firefly/Renilla Dual Luciferase Assay（SCT152)可以高靈敏度和線性檢測同一樣品中的熒光素酶和Renilla 熒光素酶活性。首先測量螢火蟲螢光素酶活性，然後再加入 Renilla 螢光素酶測試緩衝液 2.0，以同時淬滅螢火蟲螢光素酶活性和測量 Renilla 螢光素酶活性。Renilla 螢光素酶測試緩衝液 2.0 可將萤火虫螢光素酶活性淬滅至未轉染細胞的水平，因此可在同一樣本中依序測量萤火虫和 Renilla 螢光素酶活性。這是一種閃光型檢測，需要在螢光素酶樣品中加入檢測試劑後立即測量發光。螢火蟲信號會在大約 12 分鐘內衰減，而 Renilla 信號則會在大約 2 分鐘內衰減，不過這可能會視酵素水平而有所不同。

圖 4. 雙螢光素酶檢測概述。使用未轉染 HeLa 細胞或單獨轉染螢火蟲螢光素酶 (Firefly Only) 或共同轉染螢火蟲和 Renilla 螢光素酶 (Firefly + Renilla) 的細胞裂解液檢測螢火蟲和 Renilla 螢光素酶的例子。在僅轉染螢火蟲的細胞中，Renilla 信號是在反應中加入 Renilla 工作溶液後殘留的螢火蟲發光。

螢光素酶測試的應用為何？

• 基因報告器

  基因報告器是用來研究與基因表達相關的細胞事件的指標。通常，報告基因會與感興趣的 DNA 序列一起克隆到表達載體中（載有螢光素酶基因），然後轉移到細胞中。轉移後，透過直接測量報告蛋白本身或酵素螢光素酶的活性來檢測細胞中是否存在報告基因。

  例如，Sigma 和 SwitchGear Genomics™ 已經合作，在我們優化的慢病毒螢光素酶報告載體系統中獨家提供超過 10,000 個 3′UTR 區域的全基因組集合。在進行實驗時，使用 MISSION^®3′UTR Lenti GoClones, including the proper controls permits accurate interpretation of the experimental gene expression results.

• 透過 ATP 檢測細胞存活率

  由於 ATP 是新陳代謝活躍細胞的指標，因此可根據可用的 ATP 量來評估存活細胞的數量。ATP Cell Viability Luciferase Assay (SCT149, 11699709001)為量化細胞培養物中的ATP提供了高靈敏度的均相分析。本試劑盒利用萤火虫荧光素酶利用 ATP 氧化 D-Luciferin 以及由此产生的光来评估细胞培养物中可用的 ATP 量。靈敏的檢測程序只需將 ATP 檢測雞尾酒直接加入在血清補充的培養基中培養的細胞。不需要清洗細胞、移除培養基或多次移液。本試劑盒可用於檢測小至一個細胞或 0.01 皮摩爾的 ATP。產生的信號在 6 個數量級內是線性的。由於 ATP 的數量與存活細胞的數量相關聯，因此該檢測具有廣泛的應用，從測定存活細胞數量、細胞增殖到細胞毒性。

圖 5. ATP 細胞存活率檢測。萤火虫荧光素酶利用 ATP 氧化 D-Luciferin 并由此产生光，以评估与细胞数量和存活率相关的 ATP 可用量。

• 體內 成像

  生物發光成像（BLI）已經成為小鼠等小型實驗動物細胞光學追蹤的常用技術。除了低背景自發光和細胞毒性之外，BLI 還能夠利用兩種不同的螢光素酶蛋白的特定底物，使監測兩種不同的螢光素酶蛋白的表達同時可視化。在同一動物中對雙螢光素酶基因（紅色編碼優化螢火蟲螢光素酶和綠色點擊甲蟲螢光素酶）活動進行成像，可減少因實驗動物的個體差異而產生的變化。

材料

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