成功使用慢病毒進行轉導

成功使用慢病毒產品的方法和技巧。

成功的靶向依賴於優化過程中的關鍵敏感步驟，包括慢病毒轉導。以下是我們的 R&D 慢病毒專家提供的一些有用的處理和滴定技巧。如果您對基因組修飾專案有任何疑問，請隨時聯絡我們的技術支援，網址是 CRISPR@sial.com.

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• 慢病毒轉導方案概述
   

關鍵詞定義：

MOI - Multiplicity Of Infection - 轉導慢病毒粒子數量與細胞數量的比率。
VP - Viral Particle - 病毒的細胞外感染形式，由蛋白質包膜內的 RNA 或 DNA 核心組成
TU - Transducing Unit - 溶液中能夠轉導細胞並表達轉基因的功能性病毒粒子數量

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處理慢病毒：

• 慢病毒對極端的溫度變化很敏感。多次凍融循環和長時間暴露在環境溫度下會降低功能性慢病毒滴度。
  
  
• 在濕冰上解凍慢病毒粒子。 Return all aliquots not used in your initial experiment immediately to -70°C.或者，訂購工作容積等分的慢病毒，並僅解凍轉導所需的容積。
  
  
• 在丟棄到生物危險廢棄物之前，將所有病毒和任何接觸病毒或含病毒細胞的技術器皿和吸頭在 10% 漂白液中浸泡 20 分鐘。

優化實驗設置的建議和步驟

• 為您要使用的每種細胞系建立一條 消滅曲線 ，以確定選擇慢病毒整合細胞所需的最佳抗生素濃度
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
• 確定您要使用的每種細胞系和慢病毒載體組合的功能滴度（見下文）
  
  
• 確定您要使用的每種細胞系和慢病毒載體組合的感染倍數（MOI）。 MOI是轉導慢病毒粒子的數量與細胞數量的比率。 強烈建議對每一種要轉導的新細胞類型進行一定範圍的MOI測試。
  
  
  • 將 1.6 x 10⁴ 細胞放入 96 孔板的孔中，加入 120 µL 新鮮培養基。對於大多數細胞類型，0.1 - 10 MOI 的範圍是合適的。
  • 如果使用抗生素選擇：使用選擇培養基，以最低的測試 MOI 值確定有存活細胞的孔。這是您未來轉導實驗中使用此細胞系和載體的MOI
  • 如果使用螢光：以最低的測試MOI值確定具有所需可量化螢光體表達的孔。
     
• 計算建立 MOI 後所需的病毒量：
  • （每個容器或每孔的細胞總數）×（期望的MOI）= 需要的總TU
    
  • （需要的總TU）/（TU/mL 功能滴度）= 每孔需要加入的慢病毒粒子總mL

測試慢病毒粒子：

慢病毒製備完成後，需要在轉導前確定滴度。我們的慢病毒產品所報告的病毒滴度是透過 p24 ELISA 確定的。

• 我們根據 ZeptoMetrix 的 p24 分析方法確定 TU/mL。我們使用來自 Didier Trono 的轉換來確定pg/mL p24和病毒滴度之間的關係：
  
  
• 已知變量：
  1.慢病毒的 p24 蛋白/物理粒子 (PP) 約有 2000 個分子
  2.1 Da = 1 g/mol
  3.Avogadro's Number = 6 x 10²³ molecules/mol
  4.p24 蛋白質的分子量是 24 x 10³ Da = 24 x 10³ g/mol
  
  
• 公式：
  (2000 molecules/PP) ● (24 x 10³ g/mol)= 48 x 10⁶ g ● molecule/ PP ●mol
  
  (48 x 10⁶ g ● molecule / PP ● mol) ÷ (Avogadro's Number) =
  (48 x 10⁶ g ● molecule / PP ● mol) =
  (48 x 10⁶ g ● molecule / PP ● mol)g ●分子/PP ●摩爾）÷（6 x 10²³ 分子/摩爾）=8 x 10^-17 g/PP
  。
  四捨五入後，8 x 10^-17 g/PP ≃ 1 x 10^-16 g/PP
  
  將 g/PP 轉換成 pg/PP：(1 x 10^-16 g/PP) ● (1 x 10¹² pg/g) = 1 x 10^-4 pg/PP
  
  求逆：
  If 1 x 10^-4 pg = 1 PP; the inverse is 1 pg = 1 x 10⁴ PP
  
  Therefore, 1 pg of p24 protein contains approximately 10,000 PP<

將遞送建構物（也稱為轉移載體）包裝到慢病毒粒子中的效率會因轉移載體的大小和組成而有很大的不同。 因此，一個包裝合理、VSV-G 偽型的慢病毒載體，其感染率的範圍從低效轉移載體的每 200 個病毒粒子 1 TU 到 100% 高效病毒包裝時的每 1 個病毒粒子 1 TU。需要注意的是，測量重組慢病毒的功能滴度不僅取決於轉移載體的包裝效率，還取決於所使用的細胞系的轉導效率。

• 定制和現貨慢病毒製劑均提供分析證書（C of A），該證書以轉導單位/毫升（TU/mL）表示 p24 滴度。
  
  
• 透過 96 孔格式（小規模）生產時，我們的慢病毒載體的產量在 1x10⁶ and 1x10⁷ TU/mL (as measured by the p24 ELISA) 之間。
  
  
• 可提供更高的滴度和容量（大容量）。可用滴度範圍介於 1x10⁷ and 1x10¹⁰ TU/mL (as measured by p24 ELISA) 與容量選項範圍介於 0.1 mL 至 10 mL。
  
  
• p24和功能滴度之間的關聯性是向量和細胞系特定的。在每次轉導實驗開始時，首先確定您要使用的細胞系中每個載體的 p24 滴度和功能滴度之間的關係。確定功能滴度的常見方法包括：
  • 產生集落形成單位的極限稀釋協議（CFU 分析）
  • 螢光激活細胞分選（FACS）滴定
  • qRT-PCR
  • 參閱 慢病毒協議 ；頁面了解詳情
     
• 我們提供各種現成的對照和定制的對照，旨在優化實驗設置和確定 p24 滴度與功能滴度之間的關係。一旦確定每個細胞系和載體的 p24 滴度與功能滴度之間的相關性，相同的相關性就可以用於相同載體和細胞系的其他實驗。