細胞生長：概述
確保充分的細胞生長是使用細胞培養物收集準確資料的關鍵部分。細胞可以懸浮培養，也可以單層附著在 培養器，例如燒瓶、皿或多孔板。培養方法取決於細胞的內源表型和來源組織 - 因此，來自血液的細胞通常在懸浮狀態下生長，而來自固體組織的細胞通常在單層狀態下生長。同時包含附著細胞和懸浮表型的混合群體也可以共培養。
圖 1.細胞生長的階段
對於單層生長的細胞，匯合度的定義是顯微鏡觀察時出現被細胞層覆蓋的培養皿表面面積的百分比。例如，50% 匯合度表示有一半的培養皿、瓶等表面被細胞覆蓋。對於懸浮細胞，生長進度通常是根據品系或類型的推薦細胞密度來測量的，但 「融合度 」可以通過增加渾濁度和穩定的培養基顏色來評估。
細胞在培養過程中的生長通常分為四個階段，當將細胞數隨時間變化的對數繪製成圖時，會產生一條 S 形曲線，但每個階段所花費的時間因個別細胞品系和培養物而異。
滯後階段 -細胞正在適應培養條件，在此階段不會分裂。細胞附著一般發生在開始培養後的 24 小時內。
對數（對數）生長期 - 此期間細胞分裂活躍，是評估種群生長和收集一般數據的最佳時期。
高原（靜止）期 - 此期間的細胞生長速度隨著細胞接近 100% 融合而減慢，只有少於十分之一的細胞處於活躍的細胞週期。細胞在此階段最容易受傷；因此需要仔細觀察，以確保細胞在此階段開始之前或開始時被移除。
衰退期 - 作為細胞週期的自然部分，活細胞的數量會下降，因為細胞死亡在此階段佔主導地位。
在評估培養物中的細胞生長時，精確的細胞計數是最重要的，因為錯誤的細胞計數可能會導致對細胞健康的錯誤結論。細胞計數可以使用血球計測定。然而， 自動化細胞計數器 利用庫爾特原理，讓細胞一個接一個地流經電子感應器內的小孔，產生最精確的細胞計數。
圖 2.Scepter™ 3.0 手持式自動細胞計數器。
細胞生長不良的常見原因與解決方案 | ||
|---|---|---|
| Problem/Cause | Solution | |
| 從庫存解凍後沒有或只有少數可存活的細胞 | ||
| 原液培養物質量不佳 | 確保用於產生原液的起始培養物已經過正確鑒定，且健康、無微生物污染，並處於生長的對數期後期（80-90% 匯合）。 輕輕地收割細胞以防止損傷。 | |
| Stock was frozen incorrectly | 培養基 和其他試劑 - - 以及凍結方案 - - 遵循供應商的建議。一般而言，凍結應該緩慢進行，大約每分鐘 1 到 3 °C，以盡量減少冰晶的形成。 使用電子可編程或機械式凍結裝置 以確保一致且適當的凍結率。 選擇最適合細胞的冷凍保護劑 。如果使用甘油，請勿存放於光線下，因為光線照射會使甘油轉換為具有細胞毒性的丙烯醛。 | |
| Stock was stored incorrectly | 為了確保最大的存活率，Stock 應始終保持在 -130 °C 以下的溫度，最好是在液氮中。由於液氮洩漏至cryovial中時，解凍過程中可能會發生小瓶爆炸的風險，因此儲存於液氮上方的氣相中比儲存於液體中更為可取。 | |
| 解凍細胞時，請遵循供應商建議的方案。一般而言，細胞應快速解凍。使用預先加熱的培養基。 儘快移除含有冷凍保護劑的培養基，以防止活力降低。 確保細胞被小心處理。 確保小心處理細胞，切勿高速旋轉或離心，因為細胞在低溫保存後特別容易受損。 | ||
| 從庫存解凍或傳代後細胞附著不良 | ||
| 增加室内湿度。 使用抗靜電裝置。 | ||
| 確保細胞溶液和所有試劑充分混合。 | ||
| 以較慢的速度旋轉瓶子。 | ||
| 細胞傳代次數過多 | 取得較少傳代次數的新細胞。 | |
| 收获细胞时汇合度太高 | 从新的细胞储量开始，在生长的对数期收获，在达到100%汇合度之前。 | |
| Media, serum, buffers, etc. are poor quality or incorrectly formulated | Discard current reagents and use new lots. | |
| CO2 levels do not match what is required by the bicarbonate-based buffering system of the media being used, leading to inadequate control of pH | 確保培養箱的 CO2 level 符合緩衝系統的需求。一般而言，緩衝液中碳酸氫鹽的濃度越高，培養箱混合氣體中所需的 CO2 濃度就越高。 | |
| See 污染問題 以瞭解預防和消除微生物污染的詳細最佳實踐。 | ||
 USB 3.0及PCI Express Gen 3.0 支持 - 技嘉7系列USB 3.0高速傳輸介面sub>2O2 | 將細胞和培養基存放在遠離螢光燈的暗處。 | |
| 確定計數樣本已充分混合，以避免細胞密度的局部變化影響細胞計數的準確性。 重新檢查所有使用血球計手動方法確定計數的計算，或考慮 自動細胞計數。 | ||
| 確保細胞混合物和所有試劑透過輕微渦旋或移液器適當混合，以避免局部濃度變化。 | ||
| 在同一時間培植的假定相同的容器之間，細胞生長不均勻可能是由於培養箱內的溫度變化所致 | 盡可能避免將培養容器堆疊在彼此之上，因為底部的容器最接近金屬架，可能升溫最快。 當存放在培養箱前方的容器比後方的容器生長較少時，請注意盡可能關閉培養箱門，並將容器移至後方。 | |
| 特定的生長模式： | ||
| USB 3.0及PCI Express Gen 3.0高速傳輸介面/td> | 保持儲水箱滿水，並對 CO2 及其他進入的氣體進行加濕。如有必要，在培養箱中繪製蒸發「熱點」圖，以便在後續實驗中避免蒸發。 | |
| 培養箱震動會導致同心圓環（在皿中）、平行條紋或不規則圖案（在瓶中） | 將培養箱放置在堅固的表面上，不要與其他設備共用，並放置在低流量區域。 | |
| 孵育箱的溫度若稍高或稍低，可能會導致圓點或交叉斑紋的圖案，這是由於架子的金屬比周圍區域提供更多的熱量所致。 | 根據需要調整培養箱溫度，並注意盡量減少開啟培養箱的時間，因為這會導致熱量流失。 | |
| 培養架不平會造成細胞密度不均勻 | 在使用前、清潔和維修培養箱後，將培養架弄平。 | |
| Presence of air bubbles in media leads to clear bands (in roller bottles), spots without cell growth (in flasks and dishes) | Pour or pipette media carefully to avoid air bubbles. | |
| 不要让容器暴露在培养箱外较低的温度下超过必要的时间。 | ||
| 過少的培養基容量會沿著培養皿和容量瓶的側壁產生細胞密度增加的環。 | 在培養容器中加入足量的培養基。 | 在培養容器中加入適量的培養基，一般的準則是每 cm2 生長面積加入 0.2-0.3 mL 的培養基 |
小心觀察
要解決細胞生長問題，首先必須意識到問題的存在。許多生長問題都很微妙，因此有必要定期詳細觀察實驗中的培養皿，不僅是部分培養皿，而是所有培養皿。在顯微鏡下進行快速評估可能並不足夠；許多特定的生長模式在細胞固定和染色後才會顯現出來。定期檢查培養基和其他試劑以尋找污染。
準確記錄
在嘗試診斷細胞生長不良並排除故障時，對培養的各個方面做好記錄可以節省時間、金錢和獨特的改良細胞（如基因敲除品系）。例如，將細胞密度規範化並記錄存儲細胞的通過數量，對於了解存儲細胞是否可能是問題的根源至關重要。
需要注意的重要資訊包括所有儲存瓶的來源、識別和無污染證明、通過數、細胞密度，以及冷凍和儲存協議。還應記錄所有試劑的成分（和濃度）、批號和首次開封/使用日期。還應記錄所有培養容器的批號。細胞培養的各個環節都應標準化並遵循詳細的操作規程。所有儲存瓶和培養容器的標籤必須準確詳盡。注意一些小細節，例如何時清潔和維護培養箱、何時更換 CO2 罐、何時對培養室進行上次支原體篩查，並記錄任何異常情況。
瞭解何時減少損失
有時候，找到問題的確切來源並不如解決問題那麼重要，因此，一次糾正多個可能導致生長不良的原因，而不是試圖隔離確切的問題，可能會更節省成本和時間。舉例來說，重新開始使用新的細胞儲備瓶和所有新的培養基、血清、緩衝液等，可能比獨立嘗試新批次的各種培養基、血清、緩衝液等，直到找到罪魁禍首更有意义。
重點介紹
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