細胞株的冷凍保存

細胞凍結的技巧與訣竅

< 如果操作不當，冷凍細胞系可能會對細胞造成損害，打亂您的實驗，並對數據收集產生負面影響。本教程展示了凍結細胞的方案、在凍結過程中幫助減少細胞損傷的提示和技巧，以及用作冷凍保存媒體的不同溶液。

下面的方案描述了使用涉及-80 °C電冷藏箱的細胞冷凍方法來冷凍保存 細胞株。ECACC 常規使用可程式速率控制冷凍機。這是凍結細胞最可靠且可重複的方法，但由於此類設備的成本超出大多數研究實驗室的負擔能力，以下將詳細介紹相關方法。如果需要定期冷凍大量細胞培養物，建議使用可程式速率控制冷凍機。

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• 目的
• 設備
• 程序
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AIM

評估細胞

收穫細胞（程序 3 和 4）

將細胞重新悬浮於新鮮培養基

移除樣品並計算細胞數量（程序 6）

離心剩餘的培養物 150 x g 5 分鐘

將細胞重新悬浮於冷凍培養基

移取 1 mL 等分細胞

轉移至液氮儲存容器

材料

• 冷凍培養基（通常為 90% FBS、10% DMSO（C6039）)
• 70%（v/v）酒精無菌水（793213)
• PBS 不含 Ca2+/Mg2+ (D8537)
• 0.05% Trypsin/EDTA in HBSS, without Ca2+/Mg2+ (T3924)
• DMSO (D2650)

設備

重點

1. 最常用的低溫保護劑是二甲基亞砜 (DMSO)，但是，這並不適合所有細胞株，例如：HL60，DMSO 不適合 HL60。例如，HL60 使用 DMSO 誘導分化。在這種情況下，應使用甘油等替代物（有關正確冷凍保護劑的詳細資料，請參閱 ECACC 資料表）。
2. 上述推薦的 ECACC 冷凍培養基被證實是適用於大多數細胞類型的良好通用培養基。另一種常用的冷凍培養基配方是：70% 基礎培養基、20% FBS、10% DMSO，但這可能不適合所有類型的細胞。
3. 培養物必須健康且處於生長的對數期。
4. 冷卻速度可能會有所不同，但一般來說，每分鐘-1 °C到-3 °C的冷卻速度適合大多數細胞培養物。
5. Frosty先生系統的另一種選擇是Taylor Wharton被動式冷凍器，將安瓿放置在Dewar頸部的液氮蒸汽中。該系統可讓安瓿逐漸下降，從而降低溫度。
6. 作為最後的手段，如果沒有其他設備，可以將安瓿放在一個隔熱良好的盒子（如邊厚至少 1 厘米的聚苯乙烯盒子）中，在 -80 °C 下放置一夜。在整個冷凍過程中，必須確保盒子保持直立。一旦凍結，安瓿應轉移至液氮儲存容器的氣相層，並記錄位置。
7. 如果使用涉及-80 °C冷凍箱的凍結方法，則必須為細胞株凍結分配一個區域，以免樣品不慎被移除。如果這種情況發生在凍結過程的關鍵部分，那麼存活率和回收率將受到不利影響。

圖 2. DMSO 瓶

圖 3. Frosty 容器先生

程序

1. 使用倒置顯微鏡觀察培養物以評估細胞密度，並確認沒有細菌和真菌污染物。收穫生長對數期的細胞。
2. 如前所述，使用胰蛋白酶/EDTA 將黏附和半黏附細胞懸浮，並在至少等於胰蛋白酶量的新鮮培養基中重新懸浮。
3. 取出一小部分細胞（100-200μL）並進行細胞計數。
4. 將剩餘的培養物以 150 x g 離心 5 分鐘。
5. 將細胞以每毫升 2-4x10⁶ cells 的濃度重新混悬於冷凍培養基。
6. 用移液管將 1mL 等分的細胞移入標有細胞系名稱、通過號、批號、細胞濃度和日期的低溫保護安瓿中。
7. 冷凍的安瓿應轉移至液氮儲存容器的氣相層，並記錄位置。

Bright-Line是Cambridge Instruments, Inc.的商標。