培養污染：概述
儘管"細胞培養污染"通常會讓人聯想到細胞間的細菌和混濁的培養基，但培養瓶中的不速之客可以有多種形式。病毒和化學污染物也會對培養物的健康造成相當大的影響，而確保細胞系沒有交叉感染對於結果的再現性是非常重要的。根據 FDA、ATCC 及其他機構的研究，估計目前所有細胞培養物中，光是支原體就有 5 - 30% 受到污染。在一項研究中，常見細胞株的病毒污染發生率超過 25%5，而非支原體病毒比支原體更有可能逃過檢測，因為培養物的健康可能無法提供其存在的線索。
圖 1.細胞污染
控制特定污染物的關鍵有時與其檢測的難易程度有關。細菌、真菌和酵母菌污染物通常是肉眼可見的，並可能迅速殺死培養中的細胞，但微妙的形態可能會使支原體等重要的微生物入侵者更難被識別。相比之下，傳統的光學顯微鏡根本無法檢測到病毒，因此病毒的發現往往是在觀察到不明原因的脫落或其他細胞健康狀況不佳甚至細胞死亡的跡象時才被發現的。
近年來，生物界面臨的最重要問題之一就是研究細胞株的污染或甚至是直接的錯誤鑑定。有關這個重要主題的更多資訊，點選此處了解交叉污染細胞株的原因和普遍性，以及如何評估細胞株身分的完整性。
細菌、真菌（包括霉菌）和酵母菌的污染通常可以用肉眼看到，表現為培養基的快速混濁和顏色變化（前提是 中加入酚紅，這是最常見的無毒 pH 指示劑）。標準的光學顯微鏡還可以發現細菌細胞和真菌結構，因此每天對培養物進行顯微鏡觀察可確保及早發現微生物污染，並在跡象初露端倪時立即採取適當的措施。尤其需要及時移除受污染的培養物，以保護鄰近的培養物以及無菌組織培養環境，包括培養箱、浴槽和生物安全櫃。此外，特定的 testing for bacteria and fungi should be used as part of a routine and regular 微生物污染的常見原因與預防。
| Root / Cause | 預防 | |
|---|---|---|
| 技術： | ||
| 操作、移液、分液 | ||
| 非無菌表面和設備 | 清除工作區域中未立即使用的物品。 | |
| 瓶頸、瓶子外側和工作表面的濺液 | 定期用 70% 的酒精擦拭。請勿倒入液體。請使用移液管、自動分液器或轉移裝置分液。 | |
| 觸摸或握持移液管時太靠近尖端、觸摸瓶頸、螺旋蓋內側 | 將移液管握在刻度上方。 | |
| 使用無菌移液管時，請使用包覆套管。 | ||
| 沉澱在培養物或瓶子上的灰塵或皮膚顆粒；在開放的平板、瓶子、皿上握住的手或器具 | 切勿在開放的器皿上方工作，切勿在開放的瓶子或皿上方工作（垂直層流和開放式工作台），或在開放的瓶子或皿後上方工作（水平層流罩）。 | |
| 操作者的頭髮、手、呼吸、衣物 | ||
| 皮膚、頭髮或衣物上的灰塵掉落或吹入培養槽中 | 徹底清洗雙手，穿著無絨毛的白大褂。使用專用於培養室的白大褂。將長髮束起，或戴上帽子。 | |
| 說話、咳嗽、打噴嚏等產生的氣霧 | 避免在感冒時工作，或戴上口罩。 | |
| 材料和試劑 | 避免在傷風的環境下工作，或戴上口罩。 | |
| Solutions | ||
| Filter or autoclave solutions before use. | ||
| 消毒程序不足 | 使用記錄溫度計或無菌指示器監控高壓滅菌器的性能。如果懷疑受到污染，則測試或培養已滅菌的溶液。 | |
| media, buffers, sera only from reputable suppliers that certify quality and source. | ||
| 玻璃器皿和螺旋蓋 | ||
| 儲存時產生的灰塵和孢子 | 瓶蓋用錫紙包紮。將瓶子拿進機罩前，先用 70% 的酒精擦拭瓶子。 | |
| 儀器、移液管 | ||
| 無菌不可靠 | Use 獨立包裝、無菌、拋棄式耗材 來自有信譽的供應商。 | |
| 接觸非無菌表面或其他材料 | 請勿抓握會進入培養容器的儀器或移液管的任何部分。 | |
| 使用中的培養瓶和培養基瓶子 | ||
| 培養箱或冰箱中的灰塵和孢子 | 使用螺旋蓋代替瓶塞。將瓶子放入罩內之前先拭抹瓶子。 | |
| 骯髒的儲存或培養條件 | 在儲存或培養期間，用鋁箔覆蓋瓶蓋和瓶頸。定期清理倉庫和培養箱。 | |
| 瓶蓋下的介質和擴散到瓶子外面的介質 | 棄掉所有在瓶頸外面顯示溢出的瓶子。請勿倒入。 | |
| 設備與設施 | ||
| 室內空氣< | ||
| 氣流、漩渦、湍流、塵埃、懸浮微粒及nbsp; | 為組織/細胞培養預留適當的空間 減少人流和不相干的活動。定期擦拭地板和工作表面。 | |
| 層流生物安全櫃 | ； | |
| 穿孔過濾器 | 定期檢查過濾器是否有孔洞和滲漏。 | |
| 過濾器髒污 | 檢查過濾器的壓降。 | |
| 洩漏，尤其是在縫隙中或工作表面下方 | 定期消毒工作表面周圍和下方。讓酒精流入縫隙中。 | |
| CO2 加濕培養箱 | ||
| 在潮濕的環境中，牆壁和架子上會滋生霉菌和細菌 | 根據製造商的規格定期清潔，並進行適當的消毒。 | |
| 孢子等、carried on forced-air circulation | Enclose open dishes in plastic boxes with close-fitting lids (but do not seal the lids). | |
| 浴缸及其他設備 | ||
| 加熱溶液的水浴中的污染 | 定期清潔和 消毒水浴槽 定期用70%酒精徹底擦拭器皿，待乾燥後再移至生物安全櫃中使用。 | |
| 氣瓶、泵等上的灰塵 | 考慮使用非水基（珠狀）加熱水浴。在進入培養室前用 70% 酒精擦拭。 | |
| 生物材料的進口 | ||
| 懷疑在源頭或運送過程中受到污染 | 單獨處理這些細胞株，最好在檢疫時處理。在不使用抗生素的情況下培養兩週，以檢查是否受到污染。使用相位對比顯微鏡和 Hoechst/DAPI染色檢測支原體，目視檢查是否受污染。 |
支原體是一種沒有細胞壁的細菌，因此不受抗生素的影響，抗生素會抑制細胞壁的形成而限制細菌的生長。支原體的形態靈活，細胞大小在 0.15 到 0.3 µm 之間，這意味著它們可以逃過通常使用 0.22 µm 孔隙過濾器的標準細胞培養過濾方法。與其他大多數的細菌污染物不同，支原體不會因為隨便的檢查而顯現出來，而且由於其形態和明顯的小尺寸，也很難用光學顯微鏡來檢測。支原體在培養液中的滴度可達 108 organisms/mL 而不會造成培養基混濁。支原體通常不會殺死受其感染的哺乳類動物細胞，但會透過改變細胞新陳代謝、造成染色體畸變、減緩細胞生長及干擾細胞附著來顯著影響培養物。簡而言之，它們可能會大幅影響使用受影響細胞株進行的大部分實驗結果。
圖 2.常見的 DNA 檢測劑，如 DAPI 或 Hoechst，可利用螢光顯微鏡顯示受污染培養物中支原體的蹤跡（右圖）。
實驗室中支原體污染的各種來源可能是一項挑戰。由於某些支原體存在於人體皮膚上，因此除了透過受污染的補充劑（如胎牛血清）傳入外，它們也可能透過不良的無菌技術傳入。要處理支原體，必須使用孔徑為 0.1 µm 或以下的過濾膜來過濾培養基和緩衝液，因為孔徑為 0.22 或 0.45 µm 的標準培養基過濾裝置無法排除這些小生物。
預防、檢測和消除支原體污染
支原體一旦污染培養物，就會迅速擴散到實驗室的其他區域。嚴格遵守 良好的實驗室實踐 是關鍵，為了成功控制支原體污染，強烈建議進行支原體的例行檢測。最常用的三種檢測方法包括 mycoplasma culture, 基於 PCR 的檢測。 我們提供各種解決方案，適用於 支原體檢測和消除。即使您不懷疑實驗室中存在支原體這種污染物，建立培養物支原體篩檢的常規也是至關重要的。
Preventing microbial contamination: are antibiotics the answer? 在組織培養中，一種是抗生素的例行使用，可以單獨使用，也可以與抗真菌劑混合使用。正如醫生處方的治療性抗生素一樣，持續或不適當地使用抗生素會導致抗藥性菌株的產生，這些菌株難以根除，而且可能需要使用對細胞培養物可能有毒的後代抗生素。最近的研究也提出了更多關於在抗生素存在的情況下，培養細胞中基因表達可能改變的疑慮。 |
病毒污染
病毒是最難檢測的細胞培養污染物之一。病毒是培養物中最難檢測的細胞培養物污染物之一，需要對大多數研究實驗室而言不切實際的顯微鏡方法。病毒可能來自病患或動物宿主細胞來源，有幾種具有生物技術意義的細胞系已被證實含有內源逆轉錄病毒。 更常見的情況是，細胞被用來培養它們的動物來源材料中的病毒感染。病毒體積細小，很難從培養基、血清和其他生物源溶液中去除。然而，由於大多數病毒都有宿主甚至組織限制，這可能會限制其跨物種或跨組織感染的能力。
除了可能影響培養細胞之外，使用受病毒感染的細胞培養物的一個主要顧慮是它們對實驗室人員健康的潛在危害。 在使用來自人類或其他靈長類動物的組織或細胞時，應經常採取特別的安全預防措施，以避免細胞培養物可能傳染病毒（HIV、乙型肝炎、Epstein-Barr、猿皰疹 B 病毒等）給實驗室人員。 有關使用具有潛在危險的組織、培養物或病毒的程序，應諮詢機構環境安全官。欲了解更多有關實驗室人員使用細胞培養物的風險評估， click here
減少細胞培養物病毒污染發生率的最佳做法：
*限制提取細胞的生物來源（供應商、動物）的數量。
*從進行病毒測試並提供無病毒細胞株認證的儲存庫中提取細胞。
化學污染
細胞培養過程中的任何非生物污染物通常被歸類為 「化學 」污染物。 這些污染物可能來自培養基或緩衝液中使用的試劑或水，或來自設備和耗材。 例子包括自由基、金屬離子、消毒劑/清潔劑殘留物，甚至在上游細菌污染物不再存在後仍然存在的內毒素。
預防化學污染的提示：
*請務必使用實驗室等級的水 來製備緩衝液和溶液，以及重新懸浮乾燥試劑。
*任何可重複使用的實驗器皿都必須徹底沖洗並晾乾，高壓消毒對洗滌劑殘留物沒有影響。
*只從提供內毒素測試認證的供應商取得培養基、補充劑和血清（FBS、FCS）。
預防和消除污染的一般提示和技術
在生物安全櫃內工作
在生物安全櫃內工作時，請記住空氣流動是幫助維持無菌環境的關鍵。後方和前方的通風口應始終保持暢通，以實現有效的氣流。
在進行任何實際程序之前，櫃內應擺放所有所需的材料，以盡量減少操作者袖子和手上污染物的傳染可能性。
在啟動氣流後至少應過二十分鐘，才能將要使用的物品放入櫃內。所有進入櫃內的物品必須先用 70% (v/v) 無菌酒精噴灑，並用 無棉絮抹布 擦拭，以防止灰塵和微粒進入櫃內。在打開任何頂部或容器之前，確保已建立良好的氣流，讓氣流清除工作區域中可能已進入的微粒。
圖 3.在安全櫃內工作
移液器和氣溶膠的預防
- 使用自動移液管輔助器，每個移液管輔助器只限在單個櫥櫃中使用。 為避免污染，請定期拆卸和消毒移液管輔助器部件。
- 盡可能使用有塞的移液管（頂部用棉花塞住），尤其是在轉移培養基時。 避免將液體吸入移液管塞。
- 避免完全接觸血清移液管，方法是部分鬆開包裝，將端部與移液管輔助器接合，然後取下紙套。
- 為避免產生污染性氣溶膠，請勿在培養基或移液管中產生氣泡。
消毒。
專為培養廢物、工作表面和設備的消毒/去污而設計的方法不僅必須最大限度地降低污染風險，還必須確保實驗室人員的安全。使用高濃度消毒劑時，務必穿戴適當的個人防護裝備 (PPE)，例如手套和護眼用具。所選手套應能防護所處理的物質。製造商的圖表將有助於確定特定任務的最佳手套。主要的消毒劑可分為幾組，其相對優點可歸納如下：
次氯酸鈉或漂白劑
- 良好的一般用途消毒劑
- 對病毒有活性
- 對金屬有腐蝕性 - 不應該用於金屬表面，例如離心機
- 易被有機物質失活，因此應經常保持新鮮
- 使用商用漂白劑在廢液中形成 10% (v/v) 的溶液，或用於表面消毒
酒精（如例如乙醇、異丙醇）
- 有效濃度：乙醇為 70%，異丙醇為 60-70%
- 對細菌有效。乙醇對大多數病毒有效，但對無包膜病毒無效
- 異丙醇對病毒無效
- 醛類具有刺激性，應限制使用
應避免使用酚類消毒劑，因為歐盟殺菌劑產品指令審查計劃不支持酚類消毒劑。
如何執行健康細胞的例行監測
。監測細胞培養是日常細胞培養的重要部分。本教程將解釋監測細胞的基本知識，包括健康的培養物是什麼樣子、細胞的融合度以及細胞培養物生長的不同階段。本影片也將顯示細菌和支原體污染的常見指標。
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參考資料
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