剝離和重新製備 Western Blotting 膜

Western 印跡是研究蛋白功能和定位的常用技術。通常，蛋白質樣本經 SDS-PAGE 分離後，轉移到硝酸纖維膜或 PVDF 膜上，然後用特異性抗體探測。核酸技術可以重複使用 Southern 和 Northern 印跡，但 Western 印跡卻很難重複使用。

Western印迹的剥离和再探查提供了几个优势：

1. 保存昂贵或数量有限的样本；
2. 使用几种不同的抗体分析给定印迹，例如，亚型或同种型特异性抗体。
3. 重新分析異常結果，並使用相同或不同的抗體進行確認；
4. 糾正使用錯誤抗體孵育的錯誤；
5. 重複使用相同印跡，節省試劑和時間成本。

有幾種從 Western 印片中剝離抗體的方案已經出版，包括利用低 pH、加熱、去垢劑和混沌劑的方案。下面介紹三種推薦方案。第一種適用於任何化學發光底物系統，使用洗滌劑與加熱的組合來釋放抗體。

第三種方案使用 ReBlot™ Plus Western Blot Recycling Kit，它是專門用來從 Western Blot 膜上剝離抗體的。這種方法的優點包括

• 避免了與β-巯基乙醇相關的氣味。
• 在 15 分鐘內去除抗體。

這些方法都無法去除顯色檢測系統（如：BCIP、4CN、DCN）產生的有色沉澱物、BCIP、4CN、DAB 和 TMB）產生的有色沉澱物。

通常，這些方案只能用於定性目的，除非已確定剝離不會定量影響特定抗原。根據使用的方法和膜類型，許多抗原至少可承受 5 次剝離循環。然而，必須考慮到在每個剝離週期中，會有小部分的膜固定蛋白被移除。

當計劃進行一輪或多輪抗體剝離的 Western 印迹實驗時，以下是一些額外的建議。

• PVDF膜比硝酸纤维素膜更坚固，因此推荐用于任何涉及抗体剥离的方案。
• 从SDS-PAGE凝胶转移后立即干燥PVDF膜可改善蛋白质与膜的结合，在计划多次剥离时尤其推荐使用。
• 先檢測低豐度抗原。
• 先使用低親和抗體，再使用高親和抗體。
• 重要：儘管建議在轉移後立即乾燥 PVDF 印跡，但在兩輪免疫檢測之間不應允許印跡乾燥。如果允許乾燥，任何殘留的抗體分子都會永久結合在膜上。

程序 1 利用加熱和清潔劑剝離

所需設備和溶液所需的設備和溶液

• 在硝酸纖維或 PVDF 膜上的標準印跡或印跡條。
• 阻斷溶液。
• 剝離溶液：100 mM 2-mercaptoethanol (M3148)、2% (w/v) SDS (L3771)、62.5 mM Tris-HCl (T6666)，pH 6.7.
• 磷酸緩衝生理鹽水 (PBS)：10 mM 磷酸鈉，pH 7.2，0.9% (w/v) NaCl。
• 淺盤，大到足以盛裝膜。
• 陽性和陰性剝離對照。

程序

1. 在通风橱中，将印迹放入剥离液中，在 50 °C 下搅拌培养 30 分钟。
2. 將印迹放入緩衝液中，攪拌 10 分鐘。
3. 可選： 重複初始檢測方案（省略一抗步驟），以確
4. 保膜上的抗體已被滅活或剝離。
5. 將印迹放入緩衝液中攪拌 10 分鐘。
6. 進行下一輪免疫檢測的阻斷步驟。

程序 2 用低 pH 值剝離

所需的設備和溶液

• 在硝酸纖維膜或 PVDF 膜上的標準印跡或印跡帶。
• 阻斷溶液。
• 剝離溶液：25 mM glycine-HCl (G2879)，pH 2,1% (w/v) SDS (L3771)。
• 磷酸緩衝生理鹽水 (PBS)：10 mM 磷酸鈉，pH 7.2，0.9% (w/v) NaCl。
• 淺盤，大到足以放置膜。
• 陽性和陰性剝離對照。

程序

1. 將印迹放入剝離液中，攪拌 30 分鐘。
2. 將印迹放入緩衝液中攪拌 10 分鐘。
3. 進行下一輪免疫檢測的阻斷步驟。

使用 ReBlot™ Plus Western Blot Recycling Kit 的第 3 步驟剝離

Re-Blot Plus 溫和抗體剝離液在硝酸纖維膜和 PVDF 膜上都有很好的效果。但是，當需要剝離高信號的膜或 Re-Blot Plus Mild 處理不充分時，Re-Blot Plus Strong Antibody Stripping Solution 會有更好的表現。

所需的設備和溶液

• 標準印跡或印跡帶，在硝酸纖維膜或 PVDF 膜上。
• 阻斷溶液。
• 塑膠膜包裝，用於儲存不會立即重新印跡的印跡。
• ReBlot™ Plus 套件
• 蒸餾水，用於試劑稀釋。

程序

注意： 要重複使用的印點或獨立條帶應在首次使用後立即準備剝離。如果不能馬上進行剝離，可以用保鮮膜包裹膜片，並將其濕潤地保存在 4°C 的 PBS 中。

1. 在塑料托盘中注入适量的 1X 抗体剥离液（试剂盒中提供）。
2. 使用镊子或镊子将印迹或印迹条浸没在剥离液中。在室溫下輕輕攪拌培養 15 分鐘。
3. 在清潔的塑料盤中注入等量的阻斷緩衝液。傳統的阻斷緩衝液如 20 mM Tris HCl, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% TweenR-20; 5% dry milk 或類似液都是合適的。
4. 用阻斷緩衝液清洗印迹兩次，每次 5 分鐘。
5. 印迹現在可以用抗體重新染色了。

材料

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參考資料

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