酪蛋白阻斷緩衝液協議

Western印迹步骤

要特异性检测固定在固体支持物上的抗原，必须阻断支持物上未被占据的位点。非特异性位点的阻断可以通过各种蛋白质和去垢剂溶液来完成；但是，阻断溶液必须与检测系统兼容。我們的酪蛋白阻斷緩衝液與多種檢測系統相容，包括螢光素和 DIG 檢測系統。

所需試劑

• 含 0.05% (v/v) TWEEN^® 20 (PBS-T) 的磷酸緩衝鹽水 (PBS)，(產品編號. P3563)
• 蛋白探針或抗體
• 0.1 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 9.5 (用於 Southern 印迹)

製備

將一個容器中的酪蛋白阻斷緩衝液溶於 800 mL 去離子水中。溶解後，加入去離子水至 1,000 mL 並攪拌混合。

儲存/穩定性

室溫儲存粉末。重組後的酪蛋白阻斷緩衝液儲存於 2-8 °C，以避免細菌污染。溶液在重組後於 2-8 °C 下可保存一週。

程序

蘇南印記阻斷

1. 將標記的核酸轉移並交聯到硝酸纖維膜、尼龍膜或帶正電的尼龍膜上後，用酪蛋白阻斷緩衝液孵育 60 分鐘（0.6 mL/cm²）在環境溫度下孵育 60 分鐘，或在溫和攪動下在 37 °C 下孵育 30 分鐘。
   注意： 酪蛋白封堵緩衝液不適用於封堵 PVDF 膜。
   
   
2. 現在可以根據您的特定方案用 DNA 片段探測膜。
   
   

Western印迹阻断、探针和检测程序

1. 蛋白转移到硝酸纤维素膜后，用酪蛋白阻断缓冲液孵育膜10分钟（0.6 mL/cm²）在環境溫度下孵育 10 分鐘，或在 37 °C、輕輕攪動下孵育 30 分鐘。或者，也可以在 2-8 °C下阻斷過夜。
   
   
2. 用酪蛋白阻斷緩衝液稀釋一抗。一抗的常見稀釋比例為 1:1,000，但也可能有所不同。稀釋可能從 1:100 到 1:100,000 或更高。研究人員必須決定最佳稀釋係數。
   
   
3. 將膜與一抗（0.6 mL/cm²）在2-8 °C溫和攪拌下孵育 1-16 小時。
   
   
4. 用 PBS-T 溫和攪動洗膜 3-5 次，每次 5 分鐘。
   
   
5. 用酪蛋白阻斷緩衝液稀釋酶-抗體結合物，孵育膜 30-120 分鐘。After the incubation, wash the membrane with gentle agitation, 5-6 times for 5 minutes each with PBS-T.
   
   
6. The membrane may now be exposed to chromogenic or chemiluminescent substrate as per the manufacturer's instructions.

對比色檢測的建議：

1. 膜應暴露於比色底物，直到出現陽性信號，但當背景開始形成時，應停止反應。
   
   
2. 對於比色過氧化酶底物，可移除底物並將膜移至 PBS 或 TBS（Tris-buffered saline，三相緩沖生理鹽水）中 0.1% 疊氮化鈉與 1% SDS 的溶液中，以停止反應。
   
   對於鹼性磷酸酶底物，移除底物並將膜移至 pH 5.5 的 0.3 M 磷酸鈉溶液中，即可停止反應。

化學發光檢測的建議：

1. 暴露於底物後，應吸掉多餘的底物，並將膜轉移到固體支持物上。建議將膜轉移到比膜本身稍大的頁面保護器上。然後將支撐好的膜放入可熱封的袋子中。用玻璃試管或吸管在膜上滾動，輕輕按壓，使膜和塑料袋之間的氣泡平滑。封好袋子，擦掉袋子外面多餘的基材。
   
   
2. 最初，應使用 1 分鐘的曝光時間；但是，如果沒有信號，則將膜暴露在膠片上更長時間。如果有多餘信號，請使用技術上盡可能短的曝光時間。有關其他提示，請參閱故障排除指南。

有關 Western 印迹檢測的建議：

1. 酵素-抗體結合物的稀釋依後續檢測所使用的底物而定，研究人員應進行最佳化。對於發色底物，一般的稀釋準則為 1:5,000；對於化學發光底物，一般的稀釋準則為 1:50,000。稀釋比率是以初始濃度 ~1 mg/mL 的酵素-抗體結合物為基礎。
   
   
2. 在敏感的系統中，會顯示指紋。請隨時使用無粉手套。避免使用帶脊的鉗子，因為這些鉗子也容易顯現。
   
   
3. 如果使用生物素-avidin 系統進行檢測，阻斷試劑應不含生物素。
   
4. 如果使用生物素-絨毛素系統進行檢測，阻斷試劑中應不含生物素。由於牛奶中含有大量可變的生物素，因此不建議在這些系統中使用酪蛋白阻斷緩衝液。 Gelatin blocking buffer (Product No. G7663) 建議用於這些系統。
   
   
5. 為了驗證第二抗體的品質，請做一個"空白"膜，其中省略第一抗體。
   
   
6. 用於檢測抗原的抗體通常可以通過將膜浸泡在含有100 mM glycine, pH 2.3的緩衝液中30分鐘並加以攪拌來去除。這並非普遍適用的程序；有些抗原會從膜上離解，因此後續的探測會很微弱或不存在。如果可能的話，許多研究人員喜歡平行製備膜，從而避免這個剝離步驟的不確定性。

疑難排解

表一

問題	可能原因	補救方法
沒有 Sigmal	沒有目標物存在	如果膜上沒有標示核酸，則無法檢測。在下一次檢測中加入陽性對照。
	沒有目標蛋白質存在	使用陽性對照檢測膜上的蛋白質來驗證轉移。nbsp;Ponceau S solution（P7170）來驗證轉移。
	過度阻斷	如果阻斷試劑的濃度過高，可能發生信號遮蔽。可以稀釋 1:1 到 1:3 來降低濃度。
	阻斷試劑中污染物的干擾 (例如：生物素系統)
	阻斷試劑中污染物的干擾（例如：生物素系統）	如果阻斷試劑被生物素污染，游離的生物素會結合鏈霉親和素結合物，使其無法進行檢測。
	阻斷試劑中污染物的干擾（如磷酸蛋白系統）	如果阻斷試劑中含有磷酸蛋白，磷酸位點將與鹼性磷酸酶結合物結合，使其無法檢測。如果沒有信號，請曝露更長時間。例如，嘗試曝光 5 分鐘和 10 分鐘。
	酵素結合物可能已失去酵素活性	確定酵素結合物是否具有活性。
高背景	太多抗體或蛋白結合物	進行抗體或蛋白結合物的滴定，直到獲得可接受的信噪比。
	不適當的阻斷試劑	增加阻斷試劑的濃度，用二分之一建議容量的水製備試劑。此外，某些抗體可能會與某些阻斷試劑產生交叉反應。
	不適當的阻斷方案	增加阻斷時間和提高阻斷溫度至 37 °C。
	不適當的清洗方案	增加清洗次數。
	在比色底物溶液中過度培養	減少染色時間。 對於比色底物，應將膜暴露於比色底物中，直到獲得陽性信號，但當背景開始形成時，應停止反應：孵育 5-10 分鐘或當顯示條帶時。所需時間可增加或減少，但不應超過 60 分鐘。 停止反應： 對於鹼性磷酸酶底物，使用 0.3 M 磷酸鈉溶液，pH 5.5。 對於辣根過氧化酶底物，使用 0.1% 疊氮化鈉與 1% SDS 在 TBS (Tris-buffered saline) 或 PBS (phosphate-buffered saline) 中洗膜。
	不適用的膠片	改用指定用於化學發光檢測的膠片，如 Kodak® Biomax® Light、MS 及 MR 膠片。
雜點	聚集的蛋白質或抗體結合物	過濾結合物，通過 0.2 微米醋酸纖維素過濾器過濾，或以 10,000 x g 離心 10 分鐘，然後使用上清液。

Southern Blotting 的參考資料

1. Sambrook J, et al.. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 9.47-9.50.

Western Blotting 的參考資料

1. Bjerrum O, Heegaard N. 1988. CRC Handbook of Immunoblotting of Proteins. Second Edition. CRC Press, p. 229-236.

2. Dunba B. 1994. Protein Blotting: A Practical Approach. NY: IRL Press, p. 67-70.

3. Fortin A, Berkova N, Tremblay S, Côté F, Rousseau F, Khandjian E. 1994. A 56- to 54-kilodalton non grata signal in immunoblot analysis using the horseradish peroxidase chemiluminescence system. Biochem. Cell Biol.. 72(5-6):239-243. https://doi.org/10.1139/o94-034