直接檢測 Southern 或 Western 印迹的明膠阻斷緩衝液

Product No. G7663

產品說明

為了特異性檢測固定在固體支持物上的抗原或目標分子，支持物上未被佔用的結合位點必須被阻斷，以防止探針和檢測分子的結合。否則，核酸探針、抗體和檢測酵素會隨意與膜上的目標分子結合。

阻斷非特異蛋白結合位點可以用各種蛋白和去垢劑溶液來完成；但是，阻斷溶液必須與檢測系統相容。明膠阻斷緩衝液與各種檢測系統相容，包括生物素、螢光素和 DIG 檢測系統。目標分子可固定於硝酸纖維、尼龍及電荷改性尼龍膜上。

試劑

明膠封鎖緩衝液以乾粉形式提供，重組後可提供 1 公升的封鎖緩衝液。

Reagents Required but not Provided

我們會在適當的地方提供產品編號。

• 磷酸緩衝鹽水 (PBS) 含 0.05% (v/v) Tween-20 (PBS-T)， 產品編號 P3563
• 蛋白探針或抗體
• 0.1 M Tris, 0.1M NaCl, pH 9.5 (用於 Southern 印跡)

製備說明

將一個容器中的明膠封裝緩衝液溶於 800 mL 去離子水中。內容物溶解後，加入去離子水至 1000 mL，攪拌混合。

儲存/穩定性

粉末於室溫下儲存。重組後，請將明膠阻斷緩衝液儲存於 2-8 °C，以避免細菌污染。溶液可在重組後於 2-8 °C下保存一週。

程序

A.   Southern印迹阻断、探针和检测的推荐程序：

      注意： 在敏感的系統中，指紋會顯示在膜上。Use powder-free gloves at all times.
       Avoid the use of forceps with ridges, as contact points also tend to show up.

1. 將標記的核酸轉移到硝酸纖維膜上，或交聯到尼龍膜或帶正電荷的尼龍膜上後，用明膠封鎖緩衝液在環境溫度下孵育 60 分鐘（0.6 mL/cm²），或在 37 °C 溫度下輕輕攪動 30 分鐘。此外，請注意，阻斷可在 2-8 °C 下過夜完成。
   注意： 如果要使用標記的核酸探針來檢測未標記的核酸目標，則必須根據優先程序，先用合適的單鏈 DNA 阻斷膜。
   
   
2. 現在可以用蛋白結合物或對核酸上的標籤有特異性的抗體來探測膜。
   
   蛋白結合物或抗體應該用含 0.05% (v/v) 吐溫-20 (PBS-T) 的磷酸緩衝生理鹽水稀釋。當使用 鏈霉親和素-鹼性磷酸酶（產品編號：S2890）時，建議初始濃度為1-10 ng/mL。S5512) 作為蛋白結合物。
   
   
3. 用蛋白結合物或抗體溶液孵育膜（0.6 mL/cm²）在环境温度下轻柔搅拌30-60分钟。
   
   
4. 用PBS-T清洗膜，轻柔搅拌，3-5次，每次5分钟。
   
   
5. 如果蛋白結合物使用鹼性磷酸酶作為酶，則必須在 PBS-T 洗滌後用 0.1 M Tris、0.1 M NaCl、pH 9.5 洗滌三次，每次三 分鐘。Tris 洗滌可除去任何殘留的磷酸鹽，並將膜平衡至鹼性 pH，以進行鹼性磷酸酶的檢測。如果蛋白結合物使用辣根過氧化酶作為酵素，則在 PBS-T 洗滌後，膜就可以接觸底物了。
   
   
6. 現在可以按照製造商的說明，將膜接觸發色或化學發光底物。   Western印迹阻断、探针和检测的推荐程序：
   1. 将感兴趣的蛋白质转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜后，用明胶阻断缓冲液孵育60分钟（0.6 mL/cm²）在環境溫度下孵育 60 分鐘，或在 37 °C 下溫和攪動 30 分鐘。此外，請注意阻斷可在 2-8 °C 下過夜完成。
      
      
   2. 用明膠阻斷緩衝液稀釋一抗。一抗的常見稀釋比例為 1:1000，但也可能有所不同。稀釋可能從 1:100 到 1:100,000 或更高。研究人員必須決定最佳稀釋係數。
      
      
   3. 將膜與一抗（0.6 mL/cm²）在2-8 °C溫和攪拌下孵育 1-16 小時。
      
      
   4. 用 PBS-T 洗膜三至五次，每次五分鐘，輕輕攪拌。
      
      
   5. 在明膠阻斷緩衝液中稀釋二抗-酶結合物，孵育膜 30-120 分鐘。孵育結束後，輕輕攪動膜，用 PBS-T 洗膜 5-6 次，每次 5 分鐘。
      
      
   6. 現在可以按照製造商的說明將膜暴露於發色或化學發光底物上。    Suggestions for colorimetric detection of labeled nucleic acid：
      1. 膜應暴露於比色底物中，直到看到陽性信號，但當背景開始形成時，應停止反應。
         
         
      2. 對於比色過氧化酶底物，可移除底物並將膜移至 0.1% SDS 的 PBS 或 TBS（Tris buffered saline）溶液中。
         
         
      3. 对于碱性磷酸酶底物，可通过去除底物并将膜转移到 0.3 M 磷酸鈉，pH 5.5.

      D.    Suggestions for chemiluminescent detection of labeled nucleic acid:

      1. 暴露於底物後，應吸掉多餘的底物，並將膜轉移到固體支持物上。建議將膜轉移到比膜本身稍大的頁面保護器上。然後將支撐好的膜放入可熱封的袋子中。用玻璃試管或吸管在膜上滾動，輕輕按壓，使膜和塑料袋之間的氣泡平滑。封好袋子，擦掉袋子外面多餘的基材。
         
         
      2. 最初，應使用 1 分鐘的曝光時間，但是，如果未見信號，可將膜暴露於膠片上更長時間。如果看到過多信號，請使用技術上盡可能短的曝光時間。有關其他提示，請參閱故障排除指南。

      E.    Western blot 檢測固定蛋白的建議：
      

      1. 酵素-抗體結合物的稀釋取決於後續檢測所用的底物，研究人員應該對其進行優化。對於發色底物，一般稀釋指引為 1:5000，對於化學發光底物，一般稀釋指引為 1:50,000。
         
         
      2. 為了驗證第二抗體的品質，請進行"空白"膜，其中省略第一抗體。
         
         
      3. 用於檢測抗原的抗體通常可以通過將膜浸泡在含有100 mM glycine, pH 2.3的緩衝液中30分鐘並加以攪拌來去除。這不是一個普遍適用的程序；有些抗原會從膜上解離，因此後續的探測會很微弱或不存在。

      如果可能的話，許多研究人員喜歡平行製備膜，從而避免這個 "剝離"步驟的不確定性。

故障排除指南
問題問題	可能原因	補救方法
無訊號	無目標存在	若膜上沒有標示核酸，則無法檢測。
	沒有目標蛋白質存在	使用 Ponceau S 溶液（產品編號 P7170）顯示膜上的蛋白質，驗證轉移。
	過度阻斷	如果阻斷試劑的濃度過高，可能發生信號遮蔽。可以稀釋 1:1 到 1:3 來降低濃度。
	使用化學發光系統曝光時間不足	第一次曝光應為 1 分鐘。如果未見信號，則曝露更長時間。我們建議嘗試 5 分鐘、10 分鐘等。如果看到過多信號，請嘗試盡可能短的曝光時間（短至 1 秒），而不要使用盒式曝光
	酵素結合物可能已經失去酵素活性	確定酵素結合物是否具有活性。
高背景	太多抗體或蛋白結合物	進行抗體或蛋白結合物的滴度測試，直到獲得可接受的信噪比。
	不適當的阻斷試劑	增加阻斷試劑的濃度，用二分之一建議容量的水製備試劑。此外，某些抗體可能會與某些阻斷試劑產生交叉反應。
	不適當的阻斷方案	增加阻斷時間和提高阻斷溫度至 37 °C。
	不適當的清洗方案	增加清洗次數。
	在比色底物溶液中過度培養	減少染色時間。 對於比色底物，應將膜暴露於比色底物中，直到看到陽性信號，但當背景開始形成時，應停止反應：孵育 5-10 分鐘或當顯示條帶時。所需時間可增加或減少，但不應超過 60 分鐘。 停止反應： 對於鹼性磷酸酶底物，使用 0.3 M 磷酸鈉溶液，pH 5.5。 對於辣根過氧化酶底物，使用 0.1% 疊氮化鈉與 1% SDS 在 TBS（Tris buffered saline）或 PBS（posphate buffered saline）中清洗膜。
	不適用的膠片	改用指定用於化學發光檢測的膠片，如 Kodak Biomax Light、MS 和 MR。
外來光點	聚集的蛋白質或抗體結合物	過濾結合物，用0.2微米醋酸纖維素過濾器過濾，或以10,000 x g 離心10分鐘，然後使用上清液。

材料

抱歉，發生意外錯誤。

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1. Sambrook JF. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition.9.47-9.50.

2. Bjerrum OJ, Heegaard NHH. 1988. Handbook of Immunoblotting of Proteins, Vol. I, Technical Descriptions. CRC Press, 1988.

3. Dunbar BS. 1994. Protein Blotting: A Practical Approach. IRL Press, NY.

4. Fortin A, Berkova N, Tremblay S, Côté F, Rousseau F, Khandjian E. 1994. A 56- to 54-kilodalton non grata signal in immunoblot analysis using the horseradish peroxidase chemiluminescence system. Biochem. Cell Biol.. 72(5-6):239-243. https://doi.org/10.1139/o94-034

JWM 7/11/03