過氧化氫酶 (EC 1.11.1.6) 的酵素分析

Description

本程序可用於所有過濾酶產品。

連續分光光度法速率還原測定（A₂₄₀，光路 = 1 cm）基於以下反應：

單位定義：一個單位的過氧化氫酶每分鐘會分解 1.0 µmole 的 H₂O₂ ，在 pH 7.0、25 °C 時，H₂O₂ 濃度則從 10.3 mM 降至 9.2 mM。H₂O₂ 的消失速率是通過觀察 240 nm 處吸光度的下降速率來跟進的。

所需的試劑和設備

1.0 M 磷酸二氢钾溶液 （产品目录编号 P8584)

1.0 M 磷酸一鹼鉀溶液 (目錄編號 P8709)

氫氧化鉀 (Catalog Number P1767)

鹽酸 (目錄編號 )

H1758)

過氧化氫 [30% (w/w), 目錄編號 H1009]

比色皿和恒溫分光光度計

注意事項

請參閱安全資料表，瞭解有關危害和安全處理實務的資訊。

配製說明 （貯存/穩定性）

試劑的製備使用超純水（25 ℃時電阻率≥18 MΩ×cm）。

1. 磷酸緩衝液（50 mM 磷酸鉀緩衝液，pH 7.0 at 25 °C）
   配制 200 mL:
   - 加入 6.15 mL 的 1.0 M磷酸二氢钾溶液 （目录编号 P8584）加入烧杯中。
   - 加入 3.85 mL 的 1。0 M磷酸鉀單基質溶液 （目錄編號 P8709）。
   - 使用超純水配成 200 mL 的最終容量。
   - 使用 1 M KOH 或 HCl 在 25 ℃ 將 pH 調至 7.0。
   
   
2. 過氧化氫溶液 [0.036% (w/w)] - 在磷酸盐缓冲液中用过氧化氢（30% (w/w), 目录号 H1009）配制。以磷酸緩衝液為空白，測定此溶液的 A₂₄₀ 。A₂₄₀ 必須介於 0.550 和 0.520 吸光度單位之間。必要時，加入過氧化氫以增加吸光度，或加入磷酸緩衝液以降低吸光度。
   
   
3. 過濾酶溶液 -
   - 過濾酶產品以凍結粉狀供應。
     b. 使用前，立即用冷的磷酸緩衝液稀釋至 ~100 單位/毫升。
          二次稀釋
        每次都必須新鮮製備。
   - 過濾酶產品以晶體懸浮液形式提供，例如目錄編號 C30。b. 使用正排量移液管，在 37 °C
         磷 酸 鹽 緩 衝 液 中 配 製 ~1,000  單 位 /mL 的初始稀釋液。
      c. 在 37 ℃ 下孵育初始稀釋液約 1 h 小時，直到達到溶解（無漩渦）。使用前，立即在 37 °C 磷 酸 鹽緩衝液中進行二次稀釋至 ~100 unit/mL.

程序

最终测定浓度 - 在 3.00 mL 反应混合物中，最终浓度为 ~50 mM 磷酸二氢钾、0.036% （w/w）过氧化氢和 ~10 单位过氧化氢酶。

1. 使用適當的恆溫分光光度計，設定在A₂₄₀ 和25 °C，將儀器空白對比含有磷酸緩衝液的石英比色皿。
2. 用移液管移取 2.90 mL 過氧化氫溶液至石英比色皿中。
   注意：一次只能進行一次測試。
3. 將比色皿置於分光光度計中，讓底物平衡至 25 °C。
4. 然後在比色皿中加入 0.10 mL過氧化氫溶液。
5. 記錄 A₂₄₀ 從 0.45 吸光度單位下降到 0.40 吸光度單位所需的時間。
6. 一式三份執行步驟 1-5。

結果

計算

。

1.	單位/毫升酵素 =		(3.45) (df)
			(time) (0.1)

Where:

3.45 = corresponds to the decomposition of 3.45 µmoles of hydrogen peroxide in a 3.0 mL reaction mixture producing a decrease in the A₂₄₀ from 0.45 to 0.40
df = 稀釋係數
time = A₂₄₀ decrease from 0.45 to 0.40 absorbance units 所需的分鐘
0.1 = 加入比色皿的酵素毫升

2.	Units/mg solid =	；	單位/毫升酵素
			mg固體/毫升酵素

材料

抱歉，發生意外錯誤。

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1. Beers Jr. R, Sizer I. 1952. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J. Biol. Chem.. 195(1):133-40.

2. Stern K. 1937. On the absorption spectrum of catalase. J. Biol. Chem.. 121561-72.