反轉錄協議

使用 ReadyScript cDNA 合成進行反轉錄的協議 (RDRT)試劑

將成分放在冰上。混和後短暫離心，收集管底部的內容物

Reagent	20μL反應的容量	最終濃度
ReadyScript cDNA Synthesis Mix (RDRT)	4 μL	1X
RNA 模板	變量	1 μg 至 10 pg 總 RNA
Rnase/DNase-free water	Variable<
總容量	20 μL

注意：對於較小或較大的反應容量，元件應按比例調整

。

Reaction

• 將試劑混入 0.2 mL 微量管或 96 孔板中，置於冰上。稍稍離心，收集反應管底部的成分。
• 培養：
  • 25°C下孵育5分鐘
  • 42°C下孵育30分鐘
  • 85°C下孵育5分鐘
  • 4°C下保溫。C
• 完成 cDNA 合成後，使用第一鏈反應的 1/5 至 1/10 (2-4 μL) 進行 PCR 擴增。如果需要，cDNA 產品可以用 10 mM Tris-HCl (pH8.0)、0.1 mM EDTA 稀釋，並儲存於 -20 °C。

Reverse Transcription-qPCRMinus RT-controls 的指引：

利用 RT-qPCR 對基因表達進行準確的量化，需要對每個 RNA 樣本中每個感興趣基因的基因組 DNA 污染進行量化。微量 gDNA 的存在通常不會干擾高拷貝參考基因的定量，但會對低拷貝基因的信號產生顯著影響。即使使用內含子序列分隔的引物或外顯子連接橋，基因組 DNA 的存在也可能因擴增假基因或非目標 PCR 產物而產生陽性信號。

由於逆轉錄酶是ReadyScript cDNA Synthesis Mix中不可或缺的組份，因此建構一個包含除RT外所有組份的正式cDNA合成對照是不可行的。檢測基因組 DNA 存在的最直接方法是繞過 RT 步驟，直接使用等量的 RNA 製備進行 PCR 擴增。例如：如果您從 1 μg 的總 RNA 開始進行 cDNA 合成，並使用第一鏈反應的 1/10 作為 qPCR 的模板；則使用 100 ng 的總 RNA 作為減去 RT 對照的 qPCR 模板。僅 RNA 反應產生的任何信號都歸因於基因組 DNA 的存在。

DNase消化總RNA：

如果微量的基因組 DNA 會影響您所感興趣基因的精確定量，請使用高品質、不含 RNase 的 DNase I 製劑來去除殘留的基因組 DNA（DNAse I，目錄編號 AMPD1-1KT）。DNase 消解後，在進行第一鏈合成之前，必須去除所有 DNase 活性的痕跡。適合的 RNA 純化方法包括苯酚：氯仿萃取後乙醇沉澱，或使用混沌鹽和矽基 RNA 純化盒或柱（GenElute™ Direct mRNA Miniprep Kit，目錄編號 DMN10）。簡單的「熱殺」程序或使用失活的漿液溶液與 ReadyScript cDNA Synthesis Mix 不相容。

相關定義

cDNA - Complementary DNA (cDNA) 是由單鏈 RNA 或信使 RNA (mRNA) 模板經由逆轉錄酶所產生的 DNA 副本。cDNA 與其模板 RNA 或 mRNA 一樣，只包含整個基因組的某些片段，對於研究特定基因的表達非常有用。cDNA 文庫是 cDNA 的集合，通常按基因組織。