動物組織 DNA 抽取與 WGA 擴增規範

WGA擴增簡介

進行遺傳分析時，動物組織是常見的材料來源。下面的協議是從動物樣本中提取 DNA 的簡單方法。一旦DNA被分離出來，就可以使用 WGA1 和 WGA2 試劑盒的全基因組擴增方法進行擴增。

建議使用 GenElute 哺乳動物基因組 DNA Miniprep Kit (G1N10)進行此程序。

1. 將 20 毫克組織放入微離心管中。
2. 消化組織：
3. 加入 20 μL 蛋白酶 K，攪拌混合。
4. 在 55 °C 下孵育 2-4 小時或過夜，直到組織完全裂解。
   可選的 RNase 處理： 如果擔心殘留 RNA，可加入 20 μL RNase A 溶液，室溫孵育 2 分鐘
5. 裂解細胞：渦旋 15 秒。在樣品中加入 200 μL 裂解液 C。徹底攪拌，因為均勻的混合物對高效裂解非常重要。在 70 °C 下孵育 10 分鐘。
6. 準備色譜柱：在每個預先組裝好的 GenElute MiniPrep 結合柱中加入 500 μL 柱製備液，然後以 12,000 × g 離心 1 分鐘.
7. 準備結合：在裂解樣品中加入 200 μL 乙醇，攪拌混合：將樣品管中的全部內容物轉移到步驟 5 處理過的結合柱中。以 ≥6500 × g 離心 1 分鐘。丟棄含有流出液的收集管，並將結合柱放入新的 2 ml 收集管中。
8. 首次洗滌：首次使用前，按照製備說明中所述，用乙醇稀釋濃縮洗滌液。向結合柱中加入 500 μL 洗滌液，以 ≥6500 × g 離心 1 分鐘。丟棄含有流出液的收集管，將結合柱放入新的 2 ml 收集管中：向結合柱中再加入 500 μL 洗滌液，以最大速度（12,000-18,000 × g）離心 3 分鐘，使結合柱乾燥。在洗脫 DNA 離開結合柱之前，結合柱必須不含乙醇。如果可見殘留乙醇，請將結合柱再離心一分鐘。最後，丟棄含有流出液的收集管，並將結合柱放入新的 2 ml 收集管中：用移液管移取 200 μL 洗脱液直接注入結合柱中心，室溫孵育 5 分鐘。以 ≥6500 × g 離心 1 分鐘，洗脫 DNA。
9. 將 DNA 樣品儲存於 -20 °C。
   

WGA擴增

GenomePlex全基因組DNA的處理步驟使用 GenomePlex 全基因組擴增試劑盒 (WGA1) 和/或完整全基因組擴增試劑盒 (WGA2) 進行 GenomePlex 全基因組擴增的步驟表。

碎片化

1. 從上述全血抽提方案中製備 1 ng/ml 的 DNA 溶液。
2. 在 PCR 管中的 10 µL DNA（1 ng/µL）中加入 1 µL 10X 片段破碎緩衝液。
3. 將試管置於熱循環器中，95 °C，恰好 4 分鐘。
   注意：孵育是時間敏感的，任何偏差都可能改變結果。
4. 立即將樣品置於冰上冷卻，並簡短地離心。

文庫製備

1. 加入 2 µL 的 1x 文庫製備緩衝液。
2. 加入 1 µL 文庫穩定液。
3. 充分混勻，放入熱旋轉儀 95 ℃ 2 分鐘。
4. 加入 1 µL 文庫製備酵素，充分混勻，然後短促離心。
5. 將樣品放入熱循環器中，並按以下步驟孵育：
      16 °C 20 分鐘
      24 °C 20 分鐘
      37 °C 20 分鐘
      75 °C，5 分鐘
      4 °C恆溫
6. 從熱循環器中取出樣品，並簡短地離心。樣本可立即進行擴增，或於 - 20 °C 儲存三天。

擴增

1. 在整個 15 ml 反應中加入以下試劑：
      7.5 µL 10x Amplification Master Mix
      47.5 µL Nuclease Free Water
      5.0 µL JumpStart Taq DNA Polymerase (12.5 單元）用於 WGA1
     -或-
     5。0 µL WGA DNA Polymerase for WGA2
2. 徹底混勻，稍稍離心，開始熱循環：
      初始變性：  95 °C 3 分鐘
      進行 14 個循環，如下所示：  
      變性：  95 ℃ 15 秒
      退火/延長：  65 ℃ 5 分鐘
3. 循環完成後，將反應保持在 4 ℃ 或保存在 -20 ℃，直到準備分析或純化。

重擴增

1. 加入 10 µL 1 ng/µL WGA 擴增的 DNA 到 PCR 管或多孔板中。
   注意：有必要清理 WGA 反應，以減少再擴增過程中可能出現的偏差。我們建議使用我們的 GenElute™ PCR Clean-Up Kit（產品編號 NA1020）或能分離出單鏈和雙鏈 DNA 的標準純化方法。對於每個再擴增反應，在 WGA 擴增 DNA（步驟 1）中加入以下物質：
       47.5 µL Nuclease-Free Water
       7.5 µL 10X Amplification Master Mix
        5 µL WGA DNA Polymerase
2. 徹底渦旋，稍稍離心，開始熱循環。以下設定檔已針對 PE 9700 或同等的熱循環器進行最佳化：
       初始變性 95 °C 3 分鐘
       執行 14 個循環如下：
       94 °C變性15秒
       65 °C退火/延長5分鐘
3. 循環完成後，將反應保持在 4 °C，或保存在 -20 °C，直到準備分析或純化。WGA DNA 的穩定性等同於在相同條件下儲存的基因組 DNA。
   

Purification of Amplified Products

使用 GenElute PCR Clean-Up Kit (NA1020)

1. 將 GenElute Miniprep 結合柱（帶藍色 O 型環）插入所提供的收集管（如果尚未組裝）。向每根 miniprep 柱加入 0.5 ml 柱製備液，然後以 12,000 x g 離心 30 秒至 1 分鐘。
   注意：柱製備溶液可最大化 DNA 與膜的結合，使產量更一致。
2. 在 1 μL PCR 反應中加入 5 μL 結合溶液並混合。例如，在 100 µL 的 PCR 反應中加入 500 µL 的結合溶液。將溶液轉移到結合柱中。以最高速度（12,000 至 16,000 x g）離心 1 分鐘。丢弃洗脱液，但保留收集管。
3. 将结合柱更换到收集管中。將 0.5 ml 稀釋的洗滌液加在柱上，以最大速度離心 1 分鐘。
   注意：首次使用前，請務必在濃縮洗滌液中加入乙醇。
4. 將色谱柱置於收集管中。以最大速度離心柱 2 分鐘，不加任何額外的洗滌液，以除去多餘的乙醇。丢弃任何残留洗脱液和收集管。
5. 将色谱柱转移到新的 2 ml 收集管中。將 50 µL 洗提液或水加到每根色谱柱的中心。室溫孵育 1 分鐘。
   注意：用水洗脱時，請確保水的 pH 值在 5.5 到 8.5 之間。也可以使用用水稀釋 10 倍的洗脫液進行洗脫。
6. 洗脫 DNA 時，將柱以最大速度離心 1 分鐘。PCR 擴增結果現已存在於洗出液中，可立即使用或儲存在 -20 °C 中。
   

擴增產物的定量

使用全基因組擴增技術擴增的 DNA 量可在純化或不純化的情況下進行檢測。為了獲得最高品質的 DNA 樣本，強烈建議在擴增之後進行純化。可使用 Molecular Probes Inc. 的 PicoGreen^® dsDNA 定量分析 (#P-7589) 測量擴增的產物。另一種檢測擴增产物的方法是在 NanoDrop^® 分光光度計上進行分光吸收 (OD260)。此儀器可在 2-3700 ng/

大動態範圍內量測 1 μL 樣品的吸光度。

在各種動物組織上進行的全基因組擴增

我們的擴增結果在 1.5% 琼脂糖凝胶上观察。每孔上載 5 μL 的擴增产物。WGA 擴增的產物平均大小為 400 bp。如凝胶上所示，涂片模式因动物而异。使用 WGA 技術擴增的產物具有特異性，陰性對照（泳道 3）缺乏信號即為明證。

泳道 1 - 1 kb Marker
泳道 2 - 陽性對照
泳道 3 - 陰性對照
泳道 4 - 豬
泳道 5 - 牛
泳道 6 - 雞
泳道 7 - 鲶魚
泳道 8 - 蝦

使用者需提供的材料

• 動物組織樣本
• 1.5 ml 微離心管
• 微離心機 (附 2 ml 管用轉子)
• 55 °C 水浴槽或加熱塊

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材料

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