標準反轉錄協議

反轉錄

反轉錄 (RT) 是使用反轉錄酶和 dNTPs 將 RNA 轉換成 cDNA 的過程。

RT步驟可以在總RNA上進行，以便產生代表樣本中所有RNA轉錄本的全局cDNA（通常通過兩步協議），或在基因特異性方法中進行，以便僅將感興趣的RNA轉換為cDNA（通常遵循一步協議）。

以下實驗可用作基本RT協議，並可根據特定要求進行修改。慣常的做法是使用兩步流程製備 cDNA，然後在加入 PCR/qPCR 之前稀釋 cDNA，或者製備一步反應，兩個流程依序進行。

設備

• 標準 PCR 儀器或加熱塊

試劑

• RNA（濃縮液約 1 μg/μL）。
• ReadyScript^® 兩步 cDNA 合成試劑盒 (RDRT)。也可配合 oligo-dT 引物和/或隨機引物使用其他反轉錄試劑盒。
• PCR 級水：PCR級水（W1754 或 W4502），20 mL等分，冷凍；每次反應使用新的等分。

無菌 1.5 mL 螺旋蓋微量離心管 (CLS430909)

PCR 管和板，請選擇符合所需格式的一種：
- Individual thin-walled 200 μL PCR tubes (Z374873 or P3114)
- Plates
  - 96-well plates (Z374903)
  - 384孔板(Z374911)
- 孔板封條或孔蓋
  - ThermalSeal RTS™封口膜(Z734438)
  - ThermalSeal RT2RR™ 薄膜 (Z722553)

方法

製備

1. 將 ReadyScript^® kit 成分和 RNA 樣品放在冰上。
2. 混合，然後簡單離心，收集管底部的內容物。

反應

1. 確定所需反應的數量，包括對照。計算所有反應所需各成分的體積（預留 10% 額外體積以防移液誤差），並根據 表 P10-26 使用 0.2 mL 管或放置在冰上的 96 孔板結合試劑。如果使用 PCR 板，請按照板示意圖確保試劑添加到正確的孔中。

表 P10-26.ReadyScript^® cDNA 合成反應主混合物

試劑	每 單次 20 μL 反應的用量 (μL)
ReadyScript®cDNA Synthesis Mix (5× RT blend)	4
RNA 總模板-可變 (1 μg 至 10 pg)<	1
PCR級水	15

2. 密封每個反應後，輕輕攪拌以混合內容物。短暫離心，收集反應管底部的成分。
3. 根據表 P10-27 孵育反應混合物。

表 P10-27.ReadyScript^® cDNA 合成反應溫度孵育概況

溫度 (°C)	時間 (min)
25	5
42	30
85	5
4	保留

4. 完成 cDNA 合成後，使用 1:5 至 1:10 的第一鏈反應（2-4 μL）進行 PCR 擴增。  
   注意：使用 ReadyScript^® 試劑時，可將 2-4 μL 未稀釋的 cDNA 加入 PCR 而不會造成抑制。如果需要，cDNA 產品可以用 10 mM Tris- HCl (pH8.0)、0.1 mM EDTA 稀釋，並儲存於 -20 °C。