DNA 和蛋白質的去磷酸化程序

蛋白質和 DNA 的去磷酸化

去磷酸化是透過水解作用去除磷酸（PO₄^3-）基。要使蛋白質或 DNA 去磷酸化，需要一種能裂解酯鍵的酵素或水解酶。例如，磷酸酶會將磷酸單體水解為磷酸離子和帶有游離羥基 (-OH) 的分子，從而去除磷酸基。

去磷酸化的程序
Procedure	推薦 產品
1.使用小牛腸道鹼性磷酸酶對 DNA 進行去磷酸化處理	P4978
2.使用蝦鹼性磷酸酶進行 DNA 的去磷酸化	P9088
3.使用牛腸堿性磷酸酶對蛋白質進行去磷酸化處理	P0114

 

1.使用小牛腸道鹼性磷酸酶對 DNA 進行去磷酸化處理

Materials

小牛腸道鹼性磷酸酶（Product No. P4978)
10X CIP Buffer (Product No. C3225)
1 M NaCl
0.5 M Tris-HCl pH 7.9 at 25 °C
0.1 M MgCl₂
0.01 M 二硫蘇糖醇

儲存緩衝液

10 mM Tris-HCl, pH 8.2
50 mM KCl
1 mM MgCl₂
0.1 mM ZnCl₂
50% glycerol

Procedure:

1. 將 DNA 溶解於 1X CIP Buffer（0.5 µg DNA/10 µL）。
2. 對於 5' overhang DNA 加入 0.1 units/pmol CIP; for 3' overhang or blunt end DNA add 1 unit/pmol.
3. Incubate 60 minutes at 37 °C.
4. Extract with phenol/chloroform² (Product No.P3803 or P2069) 或凝膠純化 DNA。²

*注意：酚提取或凝膠純化使熱滅活不必要：對於牛腸酶，在 5 mM EDTA 存在下加熱至 75 ℃ 10 分鐘，可使 95% 以上的活性失活。注意：來自大腸桿菌的鹼性磷酸酶比牛腸酵素的熱穩定性更高，更耐熱失活。

參考資料

1. MÖSSNER E, BOLL M, PFLEIDERER G. 1980. Purification of Human and Bovine Alkaline Phosphatases by Affinity Chromatography. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 361(1):543-550. https://doi.org/10.1515/bchm2.1980.361.1.543

2. Sambrook Jea. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. p 5.72, 6.22-6.47 and E.3-E.13.. Cold Spring Harbor Laboratory.

 

2.使用蝦鹼性磷酸酶對 DNA 進行去磷酸化處理

蝦鹼性磷酸酶（產品編號 A2237） 以溶液形式在 50%甘油中供應，含有 25 mM Tris-HCl，pH 7.6, 1 mM MgCl₂ and 0.1 mM ZnCl₂.

稀释液可在 0.05 M Tris-HCl, pH 8.5 containing 5 mM MgCl₂.

在 0.05 M Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, pH 8.5.

熱失活：在去磷酸化反應後，可將酵素加溫至 60 °C 15 分鐘使其失活。

參考資料

1. Olsen RL, Øverbø K, Myrnes B. 1991. Alkaline phophatase from the hepatopancreas of shrimp (Pandalus borealis): A dimeric enzyme with catalytically active subunits. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 99(4):755-761. https://doi.org/10.1016/0305-0491(91)90139-5

2. Sambrook J, Russell D. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Takanami M. 1967. Analysis of the 5?-terminal nucleotide sequences of ribonucleic acids. Journal of Molecular Biology. 23(2):135-148. https://doi.org/10.1016/s0022-2836(67)80022-6

 

3.使用牛腸堿性磷酸酶使蛋白質去磷酸化

程序：將 100 個單位的鹼性磷酸酶（產品編號 P0114） 與 400 µg 蛋白質在 5 mM Tris pH 7.9, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, and 0.1 mM DTT for 30 minutes at 30 °C.

.

1. Labugger R, Organ L, Collier C, Atar D, Van Eyk JE. 2000. Extensive Troponin I and T Modification Detected in Serum From Patients With Acute Myocardial Infarction. Circulation. 102(11):1221-1226. https://doi.org/10.1161/01.cir.102.11.1221

參考資料

1. Labugger R, Organ L, Collier C, Atar D, Van Eyk JE. 2000. Extensive Troponin I and T Modification Detected in Serum From Patients With Acute Myocardial Infarction. Circulation. 102(11):1221-1226. https://doi.org/10.1161/01.cir.102.11.1221