造血幹細胞培養方法

Hematopoietic stem cells ；Till和McCulloch在20世紀60年代首次發現居於小鼠骨髓中的造血幹細胞，並指出：(1)造血可作為定量科學進行研究；(2)骨髓中存在克隆造血細胞，可產生混合髓系後代（粒細胞、巨 噬細胞、紅細胞、巨核細胞）；(3)其中一些細胞可自我更新；(4)在這些小鼠的脾臟中，存在可製造淋巴細胞的細胞。人類骨髓 (BM) 細胞的所有集落形成活性都存在於 CD34+ 祖細胞部分。臨床移植研究使用來自骨髓、臍帶血和週邊血單核細胞 (PBMC) 的富集 CD34+ 細胞，顯示存在具有長期組織重建能力的造血幹細胞。以下是常用的 體外 細胞培養方案和測試，用於從各種組織中分離、擴大、分化和表徵人類CD34+造血幹細胞群。

Isolation of Human CD34+ Hematopoietic Progenitor Cells

人類CD34+造血幹細胞的分離

人類CD34+造血幹細胞可根據表面標記的表達，使用流式細胞計分離出。原始多能造血祖細胞的表型為 CD34+/CD38-/CD45RA-/CD71- expression.其他造血祖先的陽性標記包括 CD133+, CD90+ (Thy-1), ALDH+ and Sca-1+。造血祖先的其他陰性標記包括成熟血系 (Lin-) 標記： CD2-, CD3-, CD19-, CD41-, CD16-, CD14-, and CD15-。 理想的樣本是新鮮、抗凝的血液或組織樣本。製備細節因特定組織來源而異。

1. 將樣本以 1:1 稀釋於不含 Mg2+ 或 Ca2+ 的 D-PBS (D8537)。
2. 將 20 mL Ficoll (F5415) 倒入 50 mL 的試管中，然後將 25 mL 稀釋的血液或骨髓慢慢分層（傾斜試管並將細胞沿試管邊緣流下）。
3. 室溫 1100g 離心 20 分鐘。
4. 移除頂層的一半，並丟棄。
5. 小心移除「混濁」的介面層（約 10 mL），並移入乾淨的 50 mL 管中。用 50 mL 不含 Mg2+ 和 Ca2+ 的 PBS（D8537）洗滌這些細胞。
6. 將細胞重懸於含血清或蛋白質的培養基（D-PBS 或 Hank's 含 2-6% FBS or HSA）。
7. 離心細胞，用不含 Mg2+ 和 Ca2+ (D8537) 的 D-PBS 洗兩次。
8. 用冷 NH₄Cl (A9434) 溶液重新懸浮 3-4 倍於原始樣品體積的 RBC，裂解並移除 RBC。
9. 在冰上孵育 10 分鐘。
10. 離心細胞，用不含 Mg2+ 和 Ca2+ 的 D-PBS (D8537) 洗兩次。將細胞重懸於含血清或蛋白質的培養基（D-PBS 或含 2-6% FBS or HSA 的 Hank's）中。
11. 在 Hank's + FBS 10⁷/mL 中重悬细胞。
12. 取出细胞样本作为对照（~10⁵ 细胞/管），如下所示：未染色細胞；FITC、phycoerythrin 和 Cy5 的非相關抗體對照；FITC、phycoerythrin 和 Cy5 的單色陽性對照。
13. 在剩餘的細胞中，加入所選程序的適當抗體。在 4 °C 下孵育細胞 30 分鐘。
14. 清洗細胞兩次，重悬於含有 2 µg/mL 碘化丙啶 (PI) 的 Hank's + FBS P4170。
15. 在開啟流體系統之前，移除流體過濾器，並使用注射器和鈍針注入足夠量的過濾 10%漂白劑 (425044)，使其充滿樣品管路。
16. 取下注射器，裝上新的乾淨過濾器，重新裝配流體系統。
17. 打開流體系統，用過濾過的 10%漂白劑的樣品管運行約 10 分鐘。
18. 移除漂白劑管，用無菌鞘液反沖樣品管。
19. 用酒精沖洗樣品管外部，然後用無菌 D-PBS 沖洗。根據正向和側向散射及 PI 染色（PI-存活細胞）來分選細胞。然後以高表現的 CD34 和低表現的 CD45、CD38 及 CD71 來分選細胞。

圖 1. 以流式細胞計法分析人類造血幹細胞標誌以流式細胞計法分析來自不同供體的工作臺規模造血幹細胞擴增特性，發現 Stemline™ 造血幹細胞擴增培養基可以產生顯著的已承諾（藍色，CD34-/CD15+/CD41+）和早期（紅色，CD34+/CD15-/CD41-）造血祖細胞擴增。

人類 CD34+ 造血祖細胞的擴增

1. 準備細胞培養基。按照說明將PromoCell HPC Expansion Medium DXF (C-28021)的Basal Medium和Supplement Mix混合。然後加入適量的 PromoCell Cytokine Mix E (C-39890/C-39891)，以獲得完全補充的擴展培養基。在 37 °C、5% CO₂ 的培養箱中預先平衡適量的補充培養基 30 分鐘：將 HPCs 以 5X10³ cells/ml 的密度培養在預先平衡的培養基中：在水浴中解凍細胞 2 分鐘。解凍後，立即以每毫升 5,000 個細胞的密度移入預先平衡的培養基。每瓶冷凍保存的細胞至少使用 9 毫升培養基。
2. 在 37 °C 和 5% CO₂ 下培養細胞 4 天。若要更換部分培養基，請將細胞從培養箱中取出。要製作單個細胞懸液，用移液管上下移動幾次，將組織培養容器中的全部內容物移入 50 ml 錐形管中。以 240 x g 的速度將細胞旋轉 10 分鐘。然後，小心吸出上面三分之二的培養基。將細胞輕輕地重懸於剩餘的三分之一培養基，並用新鮮的細胞因（cytokine-supplemented）HPC Expansion Medium DXF (C-28021)補充至原始容量。再培養 6-8 天，讓細胞充分擴張。如上所述，每 3 天更換三分之二的培養基。
3. 從含有擴增的 HPCs 的組織培養容器中收集培養基，收穫細胞。用移液管上下移動幾次，以釋放鬆散附著的細胞，並獲得單細胞懸浮液。
4. 用 PromoCell HPCs Expansion Medium DXF (C-28021)重悬细胞并计数。HPC 現已準備好用於您的實驗。

圖 2. 人類 CD34+ 造血幹細胞的形態。骨髓衍生的分離人類 CD34+/CD38 造血幹細胞的懸浮培養（A, 10X 和 B, 40X）。

集落形成單位（CFU）細胞測試

集落形成單位（CFU）細胞測試，或稱CFC測試，是透過造血祖細胞在半固體培養基（如甲基纖維素或瓊脂）中形成集落的能力，來研究造血祖細胞的增殖和分化。由固定數量的輸入細胞所形成的集落數量和形態可提供有關祖細胞分化和增殖能力的初步資訊。此測試可用於評估骨髓細胞（粒細胞、單粒細胞、紅細胞和巨核細胞），但不適用於淋巴細胞系的分化。

1. 將一小瓶冷凍的CD34+造血幹細胞（C-12921）在37 °C快速解凍，或使用新分離的細胞。
2. 取3X10³ 細胞放入含有冷2% FBS/IMDM的無菌微管中。預先調整2% FBS/IMDM 的體積，使最終的懸浮體積約為0.3 mL。
3. 將細胞攪拌，並將整個0.3 mL的細胞懸浮液轉移到3 mL等分的解凍和補充的造血祖先擴展培養基DXF (C-28021)中。在此階段可加入額外的甲基纖維素（1%）（M7027）和額外的細胞因子來誘導系分化。
   
4. 用力攪拌，讓試管靜止 3 分鐘（氣泡應浮到頂部）。
5. 將 16 號鈍頭針接上 3 mL 注射器，吸取 2.2 mL。不要吸取大氣泡；一開始就將其推出幾次。將 1.1 mL 分別推入兩個 30 mm 未處理過的平皿中，並旋轉平皿使混合物均勻攤開。
6. 將重複的平皿放置在 100 mm 的平皿中，並放置一個盛有 3 mL 無菌水的水皿以增加濕度。培養 14-17 天。
7. 在標有計分格的培養皿中，用 40x 放大倍率的倒置顯微鏡根據菌落的形態進行定性和計分。
8. 為了進一步分析分化和增殖，可以將整個 CFU 分析板中的細胞懸浮在數冊室溫 2% FBS/IMDM 中進行回收。在 4 °C 下以 300 x g 離心 10 分鐘後，將細胞重懸於 2% FBS/IMDM 中，進行計數，並使用抗體染色進行流式細胞計，或使用 Cytospin 離心機轉移到玻片上進行 Giemsa 染色。

圖 3. 人類CD34+造血幹細胞的集落形成單位（CFU）細胞測試結果。A) 從正常健康人骨髓中分離出的人類 CD34+ 造血幹細胞在含 Epo 的甲基纖維素 Stemline™ HSC 培養基或含 Epo 的甲基纖維素競爭者培養基中培養。培養 12 - 16 天後，使用倒置顯微鏡對培養物進行評分。對培養物的爆破形成單元-紅細胞（BFU-E）、集落形成單元-粒細胞、-單核細胞（CFU-GM）和集落形成單元-粒細胞、-紅細胞、-巨噬細胞和巨核細胞（CFU-GEMM）進行評分。B)已分化的人類 CD34+ 造血祖細胞顯示人類粒細胞集落，包含粒細胞和巨噬細胞的克隆形成前體 (CFU-GM) 和人類紅細胞祖細胞集落 (BFU-E)。CFU-GM 集落呈現相對均質的形態，通常具有集中的中央核心細胞，周圍有密度較低的細胞暈。BFU-E 菌落常被稱為具有葡萄狀的形態，大小從包含數百個紅細胞的單一大型簇到包含數千個細胞的 14 個或更多簇不等 (40X 放大)。