小鼠胚胎幹細胞培養程序與方案

以明胶溶液涂布平板
使用 ESGRO^® ；Medium Supplement
菌落挑選
疑難排解指南
材料

引言

轉基因和基因敲除技術的發展為分析基因功能提供了有效的工具。其中最重要的是能夠在體外分離和培養小鼠胚胎幹細胞 (ES)。ES 細胞來自早期小鼠胚胎的內側細胞團，可形成所有組織，包括生殖組織。小鼠多能 ES 細胞體外培養和維護的高效程序對基因靶向實驗的成功至關重要。我們提供多種小鼠 ES 合格產品，為研究人員可靠地培養小鼠 ES 細胞提供方便且具成本效益的解決方案，包括 ESGRO mLIF 補充劑、原代小鼠胚胎纖維母細胞、小鼠 ES 細胞株、幹細胞篩選 FBS 及專利無血清培養基。

這裡描述的細胞培養方案包括 體外 使用小鼠胚胎纖維母細胞和 ESGRO mLIF 在含血清的培養基中培養小鼠 ES 細胞。需要注意的是，本手冊中包含的方案僅作為指南，鼓勵優化培養方案以確保成功。

針對 ES 細胞的實驗大綱 - 一步一步來

規劃出從第 1 天到第 16-19 天的流程圖。注意，根據 ES 細胞的生長情況，天數可能需要移動。電穿孔、篩選、挑選和製備 DNA 將需要 2-3 週，包括週末。

Day No.	應用	節號
0	製備電鍍用培養板。	三
1	準備 PMEF Feeder 細胞板，用於 ES 細胞擴增 Et electroporation（如適用）。	四.
2	檢查 PMEF Feeder 細胞板，解凍 ES 細胞、XII.
3	飼養 ES 細胞；如需要，進行通道、XII.
4	飼養 ES 細胞；如需要，可通過。準備靶向向量：線性化...-100 pg靶向載體（每次電穿孔需要15-30 pg線性化載體），用EtOH沉澱（不需要苯酚化）、XII.
5	電穿ES細胞.	六、XIII.
6-10	ES細胞轉換體的選擇.	VII、XIV.
9-11	挑選 ES cells.	VIII、XV.
12-13	篩選ES細胞、XV.
14	冷凍ES細胞克隆並保留複製孔以培養ES細胞進行DNA分離、X.
	準備基因組 DNA 用於 Southern 印迹分析。	九
16-19	使用 RESGRO 分析後回收克隆。培養基。	三十一.

用明胶溶液涂布平板

1. 使用前将 0.
2. 在培養罩中，在無菌條件下，按照右表的建議將膠液加到平板的每個孔中。
   注意：加入足夠的明膠溶液，以充分覆蓋塑料器皿表面。
3. 在室溫下，在層流罩中蓋上皿蓋，將明膠溶液在孔中放置至少 30 分鐘。
4. 吸出明膠溶液並丟棄。立即向培養皿中加入培養基和細胞。加入細胞前不要讓平皿乾燥。

板	數量/井
96 井	100 μL
48 孔	300 μL
24 孔	0.5 mL
12 孔	1.0 mL
6 孔	1.5-2.0 mL
30 mm	1.5-2.0 mL
60 mm	3.0 mL
100 mm	4.0-5.0 mL

Plating PMEF Feeder Cells

EmbryoMax^® ；原代小鼠胚胎成纖維 (PMEF) 供養細胞以冷凍小瓶形式提供，每瓶含有 5-6 x 10⁶ cells at passage 3 (2-3 population doublings per passage)。建議在培養 ES cells 前一天培養 PMEF feeder cells，以保證 PMEF cells 約 95% 的融合度。如果 ES 細胞早於 PMEF 接代後一天接代，接代層中可能會出現一些小縫隙。

1. 在解凍PMEF細胞之前，用明膠溶液（第III節）塗層平板/瓶。
2. 在 37 °C 水浴中快速解凍 PMEF 小瓶，並轉移至 15 mL 管中（已經含有 10 mL 溫暖的 PMEF 飼料細胞培養基。
3. 輕輕倒轉試管以分散，然後以 300xg 離心 4-5 分鐘。
4. 移除上清液，將細胞顆粒重懸於溫的 PMEF 飼料細胞培養基。
5. 從板/瓶中移除明膠溶液，並按下頁表 4.1中建議的密度等分 PMEF feeder cells 懸浮液。
6. 在 37 °C、5% CO₂下培養 PMEF Feeder cells。使用 圖 4A、B 和 C 作為估計正確 PMEF 密度和外觀的指南。膠化平板可使用 12-14 天。

Volume (mL)/flask or well	Growth Area (cm2)	No.飼料細胞/瓶或孔
12	75	3.75 x 106
6	25	1.25 x 106
.mm 板	10	56	2.8 x 106
5	21	1.0 x 106
4	9.5	4.75 x 105
2	4	2.0 x 105
1	2	1.0 x 105
0.1	0.32	1.5 x 104

圖 4. A)密度正確的 PMEF 供養細胞 B)密度過低的 PMEF 供養細胞 C)密度過高的 PMEF 供養細胞

使用 ESGRO^{® 進行 ES 細胞培養} 培養基增補劑

ESGRO^® 增補劑是小鼠 LIF 蛋白的特殊配方。不同於一般 LIF 以重量銷售，每批 ESGRO^® 補充劑是根據其生物活性來銷售。ESGRO^® mLIF培養基增補劑的優點包括：對小鼠ES細胞分化的抑制一致、無批次之間的差異，以及提高了在無飼料條件下培養小鼠ES細胞的能力。

無 PMEF 供養細胞的 ES 細胞培養

1. 解凍一小瓶 mLIF 培養基。
2. 將含有1x10⁷ ES細胞的小瓶解凍成4 mL的 ES細胞培養基 （含有1000單位/mL的 ESGRO^® 補充劑）。離心（3-5 分鐘），將細胞重懸於 10 mL ES Cell Medium 中。以 1-1.5 x 10⁶ cells/25 cm2（~3 x 10⁶ cells/100 mm 平板）的密度將 ES 細胞培養到膠化平板上。在 37 °C、5% CO2 下培養平板。
3. 每天檢查細胞以確定是否需要更換培養基（以培養基顏色變為黃色表示）。2-3 天後，ES 細胞培養物會擠滿大的菌落（圖 5B）。此時，以 1:5 的比例通過 ES 細胞。
4. 要通過 ES 細胞，請按所述（第 III 節）預先準備兩個 100 mm 凝膠化平板。除去 ES Cell Medium，用 DPBS 洗板兩次，加入 1.2 mL 胰酶。在 37 °C 下孵育平板 2 分鐘，然後再加入 10 mL ES 細胞培養基。用移液管使勁移動，以打碎 ES 細胞聚集體（避免形成氣泡）。
5. 向每個含有 8 mL ES 細胞培養基的膠化平板中加入 2 mL 細胞懸浮液。多餘的 ES 細胞可
6. 以每瓶 2-10 x 10⁶ cells 的濃度冷凍，以供日後使用。請注意，ES 細胞應在您打算電穿孔的前一天進行傳代。

圖 5A & B. 沒有 PMEF 供養細胞的 ES 細胞培養

使用 PMEF 供養細胞培養 ES 細胞

。

1. 將含有1x10⁷ ES細胞的小瓶解凍到4 mL的 style="background-color：rgb(255,255,255);">ES Cell Medium  (containing ESGRO^® supplement at 1000 units/mL)。離心（3-5 分鐘），將細胞重懸於 10 mL ES Cell Medium 中。
2. 從先前製備的飼料板（第四節）中取出 PMEF 飼料細胞培養基，將 ES 細胞以 1-1.5 x 10⁶ cells/25 cm2 (~3 x 10⁶ cells/100 mm 平板)。在 37 °C、5% CO₂ 下培養平板。
3. 每天檢查細胞以確定是否需要更換培養基（以培養基顏色變為黃色表示）。2-3 天後，ES 細胞培養物會擠滿大的菌落（圖 5D）。
4. 要通過 ES 細胞，如前所述（第 4 節），準備兩個含有 PMEF 細胞 的 100 mm 平板。除去 ES Cell Medium，用 DPBS 洗板兩次，加入 1.2 mL 胰酶。在 37 °C 下孵育 2 分鐘。加入 10 mL ES Cell Medium，用力移液以分散 ES 细胞聚集（避免形成气泡）。
5. 向每个含有 8 mL ES Cell Medium 的 PMEF 细胞板中加入 2 mL 细胞悬液。多餘的 ES 細胞可以每瓶 2-10 x 10⁶ cells 的濃度冷凍，以供日後使用。請注意，ES 細胞應在您打算電穿孔的前一天進行傳代。

圖 6.

電穿孔 ES 細胞

1. 在進行電穿孔的前一天晚上，用 PMEF 細胞準備 4 個平板（第四節）。/span>
   1. 在進行電穿孔的前一天晚上，準備 4 個裝有 PMEF 細胞的平板（第四節）。
   2. 進行電穿孔的當天早上，餵ES細胞新鮮的 ES細胞培養液。
   3. 當天下午，按照前面所述的方法收縮ES細胞，並測定細胞數量。1x10⁷ ES細胞是電穿孔所需的最小ES細胞數量。
   4. 將電穿孔所需的細胞以 300xg 離心 10 分鐘，然後吸出培養基。
   5. 將 ES cells pellet 重悬於 600 μL 電穿孔緩衝液中。
   6. 25-40μg基因敲除建構 DNA（已純化）應已線化、乙醇沉澱並乾燥成顆粒。在無菌罩中，將 DNA 顆粒溶解在 30 μL 的電穿孔緩衝液中，然後將溶液加入 ES 細胞中。混勻後在室溫下放置 5 分鐘。
   7. 將 ES 細胞放入 0.4 cm 的電穿孔比色皿中。在 500 μFD、0.24 kV 下對懸浮液進行電穿孔。產生的時間常數應介於 6.9 和 7.9 毫秒之間（最佳值為 7.2）。
   8. 将电穿孔后的 ES 细胞转移到 40 mL ES 细胞培养基中，用巴斯德吸管轻轻混匀。
   9. 将 ES 细胞悬浮液装板（每个饲养板 10 mL，共 4 个板）。
   10. 在抗生素選擇之前，在 37 °C 和 5% CO₂ 下培養約 36 小時。

   選擇 ES 細胞。

   在選擇之前，建議為每個 ES 細胞系測定一條致死曲線，以確定要使用的確切藥物濃度。以下選擇方案可作為指南：

   • 新霉素 (G418) 在 129SVEV 和 129SVJ 細胞中： 350μg/mL進行 兩天，然後以150μg/mL進行 其餘的選擇。 共選擇 5-7 天
   • 新霉素 (G418) 在 C57BL6/J 細胞中： 275μg/mL一天，200 μg/mL第二天，然後 150μg/mL其餘時間 選擇。 共選擇 6-8 天
   • Hygromycin B 在 129SVEV 和 129SVJ 細胞中： 100μg/mL，2 天，然後75μg/mL，1天， 然後50μg/mL，餘下的 選擇。 總共選擇 7-10 天
   1. 選擇轉換子時，加入含有 新霉素（G418） 或 蕙黴素 B 的 ES 細胞培養基
   2. 48 小時後，細胞應明顯死亡。如果碎片過多或培養基褪色，每天更換培養基，否則每隔一天更換一次即可。如果碎屑附著在活細胞上，在更換培養基前，用無菌DPBS輕輕清洗細胞，注意不要弄掉飼料細胞層。電穿孔後應培養 ES 細胞約 10 天。

   Colony Picking

   視乎細胞系和使用的培養基，ES 細胞的菌落一般在電穿孔後 5-10 天即可挑選。最適合挑選的菌落是那些呈圓形或橢圓形、邊緣呈相對明亮、中心通常呈深色壞死的菌落。已分化的菌落呈扁平狀，周圍常有類似纖維母細胞，形成鵝卵石般的結構。選擇細胞時應避免這些細胞。ES 細胞可挑選至膠化平板或 PMEF 供養細胞層，視所用的 ES 細胞系而定。

   1. 挑選ES細胞菌落的前一天，在適當數量的24孔板上塗上 PMEF細胞 （第四節）或 明膠 （第三節）。
   2. 選擇 ES 細胞菌落前，確保您戴上手套、工作服和口罩。所有表面，包括顯微鏡、工作台、吸頭盒和移液管，都應在使用前用乙醇擦拭。
   3. 用 4 倍放大鏡檢查 ES 細胞培養物。選取的菌落之間應有足夠的間距，以確保不受周圍菌落的污染。找到所需的菌落後，用移液管吸頭在菌落上打圈，鬆開周圍的成纖維層。將移液器設定為 15 μL 的容量，用移液器吸頭刮擦菌落，使其脫落，然後吸出（吸頭內通常可見菌落）。
   4. 每次使用新的吸頭，繼續挑取和轉移 ES 細胞菌落到新的孔中，直到挑取到合適的數量為止。
   5. 在每個孔中滴入一滴胰蛋白酶（Trypsin ），37 °C孵育 2 分鐘。在此期間，將 24 孔板中的 PMEF Cell Media 更換為 500 μL 的 ES cell medium. 
   6. 6。用移液管打散 96 孔板中的每個 ES 細胞菌落，避免過多起泡。將懸浮液轉移至含有 500 μL ES 細胞培養基的 24 孔板（包括泡沫），每孔使用一個新的吸頭。
   7. 當所有的菌落都轉移後，使用設定為 400 μL 的乾淨吸頭混勻每孔。在 37 °C 和 5% CO₂ 下培養。每天用添加了 Neomycin (150 μg/mL)或 Hygromycin (50 μg/mL)抗生素的培養基餵食。如果菌落彼此靠得太近，請用 1 mL 移液管吸頭分散它們，使菌落破裂並擴散細胞（不需要胰蛋白酶，因為菌落很容易破裂）。
   8. 繼續每天更換 ES 細胞培養基，直到每個孔中的菌落覆蓋良好為止（通常為 7-10 天）。

   疑難排解指南

   。

   產生基因剔除小鼠時最常遇到的兩個問題是：(1) ES細胞分化；(2) 一旦建立了目標ES細胞克隆，就無法產生嵌合體。表 25.1 中列出了 ES 細胞分化的一些常見原因，以及如何幫助防止分化發生的建議。ES 细胞分化的程度可以通过检查 ES 细胞集落的形态来确定，或者使用 EMD Millipore 的 ES 细胞特征检测试剂盒或碱性磷酸酶检测试剂盒进行更彻底的评估。這些試劑盒含有 ES 細胞標誌物的單克隆抗體和鹼性磷酸酶檢測試劑，可區分多能和分化的 ES 細胞。表 25.2 中還包括一些常導致 ES 細胞生長緩慢的原因。表 25.3 包含了不能生成嵌合体的可能原因。

ES細胞分化的常見原因及建議。

表 25.1.

Cause of ES Cell Differentaition	Recommendations
Incorrect concentration of mLIF< /td>	ESGRO®mLIF輔助培養基使用的建議濃度應為1000單位/毫升。	ESGRO® mLIF 培養基增補劑應在 ES 細胞培養基中以 1000 單位/毫升的建議濃度使用。
ESGRO®培養基的有效期	使用前請務必檢查每一批的日期。培養基應少於 4 周，因為谷氨酰胺副產物可能對 ES 細胞有毒。每隔 2-3 天或當培養基變色時，應使用新鮮的培養基餵飼 ES 細胞。
血清	應測試新批次的胎牛血清誘導分化的效果。ES 細胞培養基通常要求血清濃度在 10% 到 20% 之間。我們建議使用EmbryoMax ES細胞合格血清。
缺乏傳代	ES細胞應每2-3天傳代一次，因為頻繁傳代會移除已分化的細胞。只有未分化的 ES 細胞才能在頻繁的傳代中存活。請參閱圖 25A-25G 以了解 ES 細胞的融合度和已分化的 ES 細胞。
消毒劑	消毒劑如 Roccal®®製劑，應避免在培養 ES 細胞的組織培養室和培養箱中使用。某些消毒劑疑因在水浴中使用及噴灑擦拭產生的氣溶膠而導致分化。建議使用70%乙醇來清潔組織培養表面。
feeder cells	如果使用ESGRO® mLIF培養基補充膠化平板無法控制分化，可能需要在飼料層上培養ES細胞。生長受阻的成纖維細胞的建議數量請參閱第 4 節。ESGRO® 補充液應以 1000 單位/毫升的濃度加入，以協助維持未分化的 ES Cells。
培養箱設定	確保在 37 °C 和 5% CO2 下培養箱讀數正確。
ES 細胞的生長速度	生長緩慢的 ES 細胞最有可能進行分化。
明膠	最好在任何時候都使用細胞培養級明膠（即使使用飼料層），因為明膠可以將組織培養板上的表面差異減到最小。建議使用EmbryoMax® ES細胞合格的0.1%明膠溶液。
低度污染	在培養基中定期使用Pen/Strep通常會掩蓋支原體等物質的低度污染。建議定期檢測您的 ES 細胞株是否受到支原體污染。

ES 細胞生長緩慢的原因及建議

表 25.2.

Cause of Slow ES Cell Growth	Recommendations
Insufficient serum	理想情況下，血清濃度應介於 10% 至 20% 之間；然而，每個 ES Cell 品系的血清濃度會有所不同。建議定期測試新批次的血清，以確定在不誘導過度分化的情況下快速生長所需的最佳濃度。我們建議使用EmbryoMax® ES細胞合格血清。
ES細胞數量少時	ES細胞稍微擁擠時可達到最佳生長效果。從冷凍儲備或通過細胞培養出更高密度的細胞，以增加單個集落數量。請參閱下列圖片，以瞭解 ES 細胞的融合度。

缺乏嵌合體的原因

表 25.3.

Cause of Lack of Chimeras	Recommendations
培養 ES 細胞所需的時間	一旦鑑定目標 ES 細胞克隆，請盡量減少 ES 細胞的培養時間。
ES細胞的核型	建議對ES細胞進行例行核型分析，尤其是當ES細胞系達到高倍數時。
未發現的分化	常規顯微鏡檢查可能無法發現某種程度的分化，因此有必要定期通過 ES 細胞。如需詳細評估 ES 細胞的分化情況，建議使用 EMD Millipore 的 ES Cell Characterization Kit 或 Alkaline Phosphatase Detection Kit（第 XXVII 節）。有關使用 RESGRO™ 培養液去除細胞系內已分化的 ES 細胞的資訊，請參閱本手冊第二十二節。
ES 細胞通過數	一般而言，最佳的嵌合體是由低通過數的 ES 細胞產生。If cell lines have been cultured for a high number of passages, it is recommended to use a lower passage frozen stock.
Number of ES cells microinjected	Most often ES cell lines are microinjected at approximately 8–12 cells/blastocyst.
顯微注射前所需的時間	建議 ES 細胞從組織培養板取出後儘快進行顯微注射，不要長時間放置在冰上或室温下。
ES細胞與 小鼠品系的相容性	在進行任何顯微注射或聚集程序之前，請檢查胚胎品系與ES細胞的組合，因為有些品系據報並不相容。

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