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神經幹細胞培養規程

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引言

神經幹細胞的特徵是它們能夠1)自我更新和2)產生在中樞神經系統中發現的不同細胞類型，包括神經和膠質亞型。神經祖細胞群的分離和 體外 分析對於破譯神經發育的細胞和分子機制，以及優化以幹細胞為基礎的神經失調和損傷治療非常重要。在成年哺乳類動物的大腦中，NSCs主要存在於兩個神經起源區域：海馬的牙狀回（DG）的粒下區和側腦室的室下區（SVZ）。最近，使用多能幹細胞製造病人衍生的神經祖細胞，有助於產生與許多年齡相關神經疾病更相關的 「病中菜 」細胞模型。

哺乳類動物腦部神經發育的區域。

圖 1.哺乳類動物腦部神經發育的區域。增殖的神經幹細胞存在於成年和發育中的哺乳類動物大腦海馬齒狀回的粒下區（SGZ）和室下區（SVZ）。

方法

神經幹細胞的分離神經幹細胞的分離

從神經組織分離 NSCs

  1. 小鼠或大鼠腹腔注射 230 mg/kg 戊巴比妥鈉或 400 mg/kg 阿維汀進行麻醉，然後進行安樂死。
  2. 取出腦部，以 50 mL 管子移至含有 20 mL 冷溶液 A（1XHBSS (H8264) 含 30 mM 葡萄糖 (G7021)、2 mM Hepes (H0887)、26 mM NaHCO3 (S5761)）的 10 釐米培養皿 (CLS430591)。將一小片濾紙放在 Tissue Chopper 上，使用濕的無菌棉花棒稍微弄濕濾紙，然後用彎尖鉗將腦部放在濕的濾紙上。
    關鍵步驟： 在切片和解剖過程中，保持載有腦部切片和溶液 A 的培養皿在冰上。
  3. 在解剖顯微鏡下解剖出 SVZ 和 Dentate 回（腦圖），並將解剖的組織分別保存在 15-mL 的 Falcon 管 (CLS430791)中，每個管中含有 10 mL 的冷溶液 A。
    關鍵步驟： 本步驟及隨後的步驟是針對從一隻小鼠的 SVZ 和 DG 製備中分離 NSCs 而優化的。如果您打算從一隻以上小鼠的集合組織中分離細胞，我們建議您增加 Percoll (P4937) 純化的步驟，以去除多餘的髓鞘和其他類型的細胞
  4. 完成所有腦切片的解剖後，在室溫（20-25 °C）下，將組織塊在低速離心機中以 200 g 離心 1 分鐘。
  5. 在 TC 罩中除去上清液，在每個含有組織塊的 15 ml 錐形管中加入 1 mL 0.05% Trypsin-EDTA (59417C) 。在室溫下旋轉圓錐管 10-20 分鐘。
    注意事項： 培養時間不要超過 30 分鐘，否則會降低細胞的活力。
  6. 在每個試管中加入 1mL µL 的胰蛋白酶抑制劑溶液 (T7659)，再轉動 10-20 分鐘。
    注意事項： 培養時間不要超過 30 分鐘，否則會降低細胞的活力。
  7. 預濕火磨玻璃吸管，用吸管上下攪拌 10-20 次，直到沒有組織結塊為止，然後在每個管中加入 8 mL N2 培養基（DMEM/F-12 (D6429)、N2 補充劑 (SCM012)、L-谷氨酰胺 (G7513)）。在室溫下，以 200 g 的速度將細胞打碎 5 分鐘。
    注意事項： 避免在輾碎組織時產生氣泡，因為這會降低細胞的活力。
    關鍵步驟： 將 SVZ 和 DG 分離為單細胞非常重要，因為任何剩餘的聚集體都可能導致產率降低。
  8. 用10 mL N2培養基清洗細胞兩次，每次在室溫下以200 g脫水5 min。
  9. 如果您要從2只或更多小鼠的集合組織中分離細胞，用5.5 mL N2培養基重新混勻每個細胞球，加入5.5 mL Percoll/PBS溶液，倒置試管混勻。在室溫下以 400 g 的速度將細胞沉澱 15 分鐘。然後用10 mL N2培養基清洗細胞3次，每次室溫200 g下旋轉5 min收集細胞。
    關鍵步驟： 輕輕地移除上清液，因為細胞球可能沒有牢固地附著在管底。關鍵步驟：徹底清洗去除 Percoll 是關鍵，因為殘留的 Percoll 會影響細胞活力。
  10. 用 8 mL 初始增殖培養基 (IPM) （神經幹細胞基質 (SCM003)、B27 (SCM013)、L-谷氨酰胺 (G7513)、1X Pen-Strep (P4333)、20 ng/mL FGF-2 (F0291) 和 20 ng/mL EGF (E9644)）再洗一次。
  11. 用 1 mL IPM 重悬每个细胞团（DG 细胞），用 2 mL IPM 重悬每个细胞团（SVZ 细胞），然后将细胞分板到 24 孔组织培养板 (CLS3527) 的一个孔中（DG 细胞）和 2 个孔中（SVZ 细胞）。在 CO2 培養箱中培養細胞 48 小時。
  12. 更換一半的 IPM，避免移除任何細胞。繼續培養細胞 7-14 天，每隔一天更換一半的 IPM，並監測細胞是否形成神經球。神經球應在 1-2 周後在兩個培養物中形成。

將人類 iPSCs 分化為 NSCs

雙 SMAD 抑制是一種成熟的方法，可在單層培養物中從人類 ES/iPS cells 中衍生神經祖細胞。本方案使用兩種 SMAD 抑制劑 Noggin (SRP4675) 和 SB431542 (S4317) 來驅動 ES/iPS 細胞快速分化為高度豐富的 NPCs。Noggin 可作為 BMP 抑制劑，而 SB431542 則透過阻斷 ALK4、ALK5 和 ALK7 受體的磷酸化來抑制 Lefty/Activin/TGFβ 通路。為了做出更明確及優化的神經元分化方案，Li 及其同事修改了原始方案，建立了完全以小分子為基礎的分化方法，該方法依賴三種小分子來抑制 GSK-3β、CHIR99021 (SML1046)、TGFβ、SB431542 (S4317) 及 Notch、化合物 E (565790) 訊號通路，以及人類 LIF (LIF1010)。這種新的以小分子為基礎的神經分化方案增加了神經分化動力學，允許衍生出真正多能的神經幹細胞，對指定前腦、中腦和後腦神經和膠質亞型的區域模式化線索作出反應。

應用說明： Robust Differentiation of Human iPSCs into Lineage-Specific Neuronal and Glial Cells Utilizing Dual-SMAD Inhibition

Characterization of Neural Stem Cells

神經幹細胞的表徵目前，神經幹細胞通常根據與幹細胞和/或祖細胞狀態相關的分子標記的存在，以及通過標記分析評估的更分化表型的缺失來鑒定。NSCs正向表達幹細胞標誌物Nestin (ABD69, MAB353)、Sox-2 (AB5603)和Musashi (MABE268)，而缺乏較分化的細胞系標誌物，包括神經元的βIII-tubulin (MAB1637)、星形細胞的GFAP (AB5804)和少突胶质细胞的O1 (MAB344)。

表 1.神經幹細胞標記

神經幹細胞的擴展

Culture of NSCs in 3D Neurosphere Culture

  1. 神經球培養 7-12 天後（上述步驟 1-15），收集所有原代球，不要打亂附著的細胞；室溫下以 200 g 轉 5 分鐘。
  2. 小心移除培養基，每管加入 1 mL 0.05%胰酶/EDTA (59417C)。使用 1 mL 藍色吸頭，上下吸 20 次，在 2 分鐘內消化球體。每管加入 1 mL 胰酶抑制劑溶液 (T7659)，再用移液管上下移動 10 次。每個試管加入 5 mL IPM，倒置試管數次混和，室溫 200 g 攪拌 5 分鐘。
  3. 用 1 mL IPM 重懸 DG 細胞顆粒，用 2 mL N2 培養基重懸 SVZ 細胞顆粒。用 10 µL 0.5% Trypan blue (T8154) 稀釋每個樣本中的 10µl 等分樣本，然後用血球計計算存活的細胞。
  4. 每隔一天為 DG 細胞更換一半的新鮮 IPM 培養基，為 SVZ 細胞更換新鮮 N2 培養基，連續 1 周。更換一半培養基時避免取出任何細胞。第一次通過後，將 DG 和 SVZ NSCs 維持在 N2 培養基中，每隔 2-3 天以 3X104 -1X105 cells/mL 種植 NSCs。

NSCs 的二維單層培養

我們建議在組織培養塑料或玻璃器皿上塗層 poly-L-ornithine 和 laminin。

  1. 用水稀釋 poly-L-ornithine (P4957) 的庫存濃度 (0.1 mg/mL) to yield: a. 20 μg/mL for polystyrene plates b. 50 μg/mL for glass plates.
  2. 加入足夠的聚-L-鸟氨酸溶液以覆蓋整個組織培養器表面。3.5 cm 平板使用 2 mL 容量，6 cm 平板使用 5 mL 容量，10 cm 平板和 T75 燒瓶使用 10 mL 容量。在 37 °C 加濕培養箱中培養至少一小時。
  3. 取出聚 L-鸟氨酸溶液，用無菌水沖洗一次。
  4. 為了培養、繁殖和分化 NSCs，稀釋 laminin (L2020) 至最終濃度 5 μg/ml。3.5 cm 平板使用 2 mL 容積，6 cm 平板使用 3-5 mL 容積，10 cm 平板和 T75 燒瓶使用 7-10 mL 容積。在 37C 加濕恆溫箱中孵育至少 1 小時。塗層板和燒瓶可在層壓蛋白溶液中於 2-8 °C 儲存 3 週，或於 -20 °C 儲存 6-8 個月。使用前，將塗層板或燒瓶升至室溫，吸出層壓素溶液。
  5. 從液氮中取出小瓶神經祖細胞（SCC007, SCC008, SCR055, SCC035），在37 °C水浴中培養。密切監測直到細胞完全解凍。
    重要： 不要攪拌細胞。
  6. 細胞完全解凍後，立即用 70% 乙醇消毒小瓶外部。在層流罩中，使用 1 或 2 mL 移液管將細胞移至無菌的 15 mL 錐形管中。
  7. 使用 10 mL 移液管，將 9 mL Neural Expansion Medium (SCM005, SCM004)（預溫至 37 °C）緩慢滴加到 15 mL 錐形管中。
    重要： 不要一次向細胞中加入全部容量的培養基。
  8. 用移液管緩慢地上下移動兩次，輕輕地混合細胞懸浮液。
    重要： 不要渦旋細胞。
  9. 在室溫下以 200 x g 離心 3-5 分鐘，使細胞沉澱。
  10. 盡量排出上清液。
  11. 將細胞重懸於總容量為 2 mL 的神經擴展培養基（預溫至 37 °C）中，該培養基含有 FGF-2，20 ng/mL (F0291)。
  12. 將細胞混合物平鋪於塗有聚-L-鸟氨酸和層粘連蛋白的 3.5 cm 的組織培養板上。
    重要事項： 為達到最佳生長效果，不建議在大於 3.5 cm 的組織培養板上解凍細胞。
  13. 將細胞置於 37 °C、5% CO2 加濕培養箱中培養。
  14. 第二天，將培養液換成含有 FGF-2 (20 ng/mL)的新鮮 Neural Expansion Medium（預溫至 37 °C）。
  15. 當細胞約 90 - 100% 融合時，可用 Accutase™ (A6964) 將細胞分離並傳代，或冷凍以備日後使用。細胞在任何時候都應保持高細胞密度，因此建議的傳代比例為 1:2 至 1:6。
神經幹細胞培養特性。

圖 2.神經幹細胞培養特性。神經幹細胞可以浮動的三維神經球(A)或附著的二維單層(B)生長在塗有聚 L-卵磷脂/層黏蛋白的平板上。多能神經幹細胞表達 Nestin (C) 和 Sox-2 (D)。

神經幹細胞的分化。

圖 3.神經幹細胞的分化。多能 NSCs 表達 Nestin/Sox-2，在適當的培養條件下可分化為 BIII-Tubulin 陽性的神經元 (B) 或 GFAP 陽性的星形細胞 (C) 。

常見問題

  1. NSCs的倍增時間是多久？
    人類 NSCs 每 48-72 小時加倍一次。齧齒動物的 NSCs 每 24 小時加倍一次。
  2. My cells do not adhere to the P/L coated plates, what can I do to establish a monolayer NSC culture?
    Poly-L-Ornithine/Laminin coated plates is faulty.使用新的 Poly-L-Ornithine/Laminin 溶液重新塗佈新的平板
  3. 我的細胞生長緩慢，哪裡出了問題？
    每天更換培養基，以確保快速增殖。使用新鮮的培養基和新鮮補充的 bFGF。等到細胞 80-90% 匯合後，再以 1:2 到 1:4 的分裂比例進行分裂。
  4. 我的培養物中有大量細胞死亡/浮游細胞。這是正常的嗎？
    這是一種鬆散黏附的細胞培養，細胞和細胞碎片漂浮在培養基中並不少見。
  5. 我是否必須以如此高的密度培養這些細胞，或者我可以將它們分成 1:3 或 1:4？
    與大多數細胞培養系統不同，這些細胞需要高密度培養才能高度增殖。在密度較低的培養物中，增殖速度會減慢，這可能是由於細胞與細胞之間失去了接觸。
  6. 如何將細胞分化成特定的神經表型？
    所提供的分化方案/培養基旨在作為基礎系統。對於特定的細胞類型，可根據最終使用者的興趣，制定包括額外的神經刺激因子的分化方案。

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