Human ReNcell® VM NSC Maintenance and Passaging
3D 細胞培養技術旨在為研究、藥物發現或再生醫學應用提供更好的預測細胞模型。從歷史上看，由於高水平的可溶性和不溶性毒性淀粉樣蛋白 β (Aβ) 物種無法再現真正的阿茲海默症 (AD) 病理，因此阿茲海默症 (AD) 的體外人類細胞模型一直具有挑戰性。最近，Kim等人使用β-淀粉樣蛋白前體蛋白和presenilin-1過度表達的ReNcell™ VM人類神經幹細胞系，建立了阿茲海默症的三維（3D）人類神經幹細胞模型。這種三維細胞模型能夠誘導淀粉樣蛋白-β（包括淀粉樣蛋白-β斑塊）強大的細胞外沉積，並在細胞體和神經細胞中誘導高水平的磷酸化tau以及絲狀tau。1,2,3
ReNcell 株系是高度公開的人類神經幹細胞株系，源自發育中的人腦。ReNcell® VM 和 CX 細胞分別來自於大腦腹面間腦區和皮質區，並經 myc 轉錄因子轉導。除了長期培養的多潛能神經元和膠質分化能力外，這兩種細胞系都具有表型和基因型的穩定性。
用於產生阿爾茨海默病三維 NSC 模型的方案
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Human ReNcell® VM NSC 維護與傳代
- 在 37 °C 水浴中加熱 ReNcell® NSC 維護培養基和 Accutase 溶液至少 10 分鐘。
- 清洗 ~95% 匯合的 ReNcell® VM 細胞。/a> 在 T25 燒瓶中加入 3 mL 的 D-PBS, 吸出 D-PBS 並加入 0.5 mL Accutase。
- 在 37 °C CO2 培養箱中培養細胞 3-5 分鐘，加入 3 mL 預先加溫的 ReNcell® NSC 維護培養基，然後將細胞懸浮液轉移到 15 mL 無菌錐形管中。
- 室溫下以 2,000g 脫水 3 分鐘，去除上清液，將細胞顆粒重懸於 12 mL ReNcell® NSC 維護培養基。
- 將 4 mL 的 ReNcell® 懸浮液分配到每個塗有 Matrigel 的 T25 燒瓶中，然後在 37 °C CO2 培養箱中培養 3-4d 。
注意：分裂（1:3 比例）後，ReNcell®細胞一般在 3-4d 後長大融合。如果細胞當時尚未融合，請將培養基更換為新鮮的 ReNcell® NSC Maintenance Media，再等待 1 或 2d。
Viral Infection of Human ReNcell® VM NSCs
- 如步驟 1-4 所述，準備 ReNcell® VM 細胞以進行感染，將細胞從匯合的 T25 燒瓶中移出並旋轉。用 12 mL 預先溫過的 ReNcell® NSC Maintenance Media 重懸細胞顆粒，然後將 2 mL 的細胞懸浮液分配到塗有 Matrigel 的六孔板的每個孔中。輕輕交叉搖動培養皿，讓細胞沉澱過夜。
- 用 2 mL 預溫的 ReNcell® NSC 維護培養基取代培養基。當細胞達到 70-80% 匯合度時，每孔加入 6 × 106 轉染單位 (TU) 的病毒粒子，以達到約 1 的感染倍數 (MOI)。 輕輕混和，培養細胞過夜。
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- 用 2 mL 預先溫過的 ReNcell® NSC 維護培養基清洗細胞兩次，然後塗上 2 mL 的培養基。隨著時間的推移，融合度應該會增加。感染後 48 小時可預期轉基因表達，並應可透過螢光顯微鏡檢測到。
注意： 仔細監測培養物。如果觀察到細胞異常死亡，請立即更換培養基。
- 第4天，如果細胞完全融合，按照步驟1-5所述通過細胞，並重新開始正常培養。如果細胞到此時還沒有完全融合，則更換培養基，而不是傳代，培養直到細胞達到融合。要生成同時表達 APPSL/GFP 和 PSEN1(E9)/mCherry 的細胞（ReN-mGAP 細胞），可以在分裂後用不同的慢病毒載體再次感染轉染的細胞，如步驟 6-8 所述。
- 通過顯微鏡檢測 GFP 和 mCherry 螢光以及過度表達 APPSL 和 PSEN1(E9) 的 western 印迹分析來驗證感染。通常，>50% 的感染細胞會明顯地表達螢光標記。
註： 感染、驗證的細胞可冷凍並儲存在液態 LN2 罐中至少 1 年，然後再進行流式細胞儀分析。
圖 1. 用 APPSL-GFP (A) 或 PSEN1-RFP (B) 慢病毒感染 ReNcell VM 的螢光圖像，MOI =20。 病毒轉錄後第 3 天，>80% 的 ReNcell VM 會表達與阿茲海默症相關的轉錄基因。
Enrichment of high-expressing transgenic Human ReNcell® VM NSCs
- 培養轉化的 ReNcell®hVM 細胞直到達到匯合（95% 匯合的 T25 試管可得到 ~2-3 × 106 cells）。雖然最佳的細胞總數取決於感染效率，但至少應有 2-3 × 106 成功轉染的細胞（用螢光細胞分類或螢光顯微鏡檢測時）。
- 如步驟 1-4 所述分離細胞，但用 4 mL D-PBS 重懸細胞顆粒。使用自動細胞計數器測定細胞數目。
- 在室溫下以 2,000g 輕微旋轉細胞，除去上清液，將細胞顆粒重悬於冰冷的分選培養基（每 107 個細胞 1 mL）。
- 要使細胞單一化，用 1000uL 移液管吸出細胞懸浮液，將吸管尖端輕輕壓在 細胞過濾網上，呈 90° 角，用力排空移液管。若有阻塞，請小心移動移液管尖橫過網孔，同時保持壓力。將過濾後的懸浮細胞收集於 15 mL 離心管中。
註：懸浮細胞可在螢光激活細胞分選前在冰上保存至少 1 小時。
- 使用 GFP（488 nm，200 mW 激發，530/30 發射）和 mCherry（561 nm，150 mW 激發，610/20 發射）進行螢光激活細胞分選，為最終的批量分選定義和分選群。設置閘門，選擇單獨高表達 APPSL/GFP、單獨高表達 APPSL/PSEN1(E9)/mCherry 或 APPSL/GFP 和 PSEN1(E9)/mCherry 共同高表達的細胞。
- 分選後，立即將細胞平板到 Matrigel 矩陣包被的平皿中。
注意：懸浮的細胞可先在細胞收集管中冰凍保存 1 小時，再進行平板。
注意：懸浮的細胞可存放在細胞收集管中，在冰上放置 1 小時後再進行電泳。在 4 °C、2,000g 下旋轉細胞 3 分鐘，然後移除上清液，並將沉澱物重悬於預溫的 ReNcell® NSC 維護培養基（每 2 × 106 收集的細胞 1 mL）中。
注意：確定重懸浮後的細胞濃度，並相應調整容量。
將細胞播種在塗有 Matrigel 矩陣的 24 孔板上，初始密度為每平方厘米 2 × 105 個細胞。將細胞按順序擴展到塗有 Matrigel 基質的六孔板中，最後再擴展到塗有 Matrigel 基質的 T25 燒瓶中。在此階段製作多個細胞儲備。按照步驟 1-5 所述進行細胞傳代。當培養出足夠的細胞時，進行下一步。
注意：懸浮的細胞可存放在細胞收集管中，在冰上放置 1 小時後再進行電泳。在 4 °C、2,000g 下旋轉細胞 3 分鐘，然後移除上清液，並將沉澱物重悬於預溫的 ReNcell® NSC 維護培養基（每 2 × 106 收集的細胞 1 mL）中。
注意：確定重懸浮後的細胞濃度，並相應調整容量。
圖 2.Alzheimer's In a Dish™ 克隆 FAD ReNcell® VM 人類神經幹細胞系。Alzheimer's in a Dish™ 是一套專利的永生化單細胞衍生 ReNcell® VM 人類神經祖細胞，可表達多種 FAD 基因突變的穩定螢光標籤 AD 基因。克隆的 FAD 神經祖細胞分泌不同數量的總 Aβ，且 Aβ42/40 的比率也不同。所有克隆FAD細胞系都表達神經幹細胞標誌物Nestin (B)和Sox-2 (C)。例如：ReN-mGAP10克隆D4神經祖細胞（SCC008FAD2）與表現APP（Swe/Lon）-GFP、(D)PS1（deltaE9）-mCherry (E)的多核慢病毒雙重感染，合併圖像(F)。
- 使用前 1 天，從 -80 °C 冷凍庫中取出 Matrigel 基質庫存，放入 4 °C 冰箱中。
- 在五個塗有 Matrigel 的 T25 烧瓶中培養 ~95% 融合的對照和 FAD ReNcell® VM 細胞。一個匯合的 T25 燒瓶中 ReNcell® 細胞的大約數量是 3-4 × 106。傳代細胞後一般需要 2d。
- 用乙醇噴灑冰桶，並在細胞培養罩中暴露於紫外線下約 20 分鐘。
- 將ReNcell®分化培養基及Matrigel原液置於冰上。
- 每個 T25 燒瓶用 3 mL D-PBS 洗一次細胞，然後用吸管小心地移除。
- 在每個瓶中加入 0.5 mL Accutase™ 試劑，在 37 °C 下培養細胞 3-5 分鐘。
- 用力拍打瓶側使細胞脫落，直到成團的細胞完全脫離。
- 用 3 mL ReNcell®分化培養基重懸細胞，並用移液管在燒瓶內上下移動至少三次。
- 將所有五個 T25 燒瓶中的細胞懸液轉移到 15 mL 管中。
- 在室溫下以 2,000g 離心 2 分鐘。
- 用吸管移除培養基。
- 將細胞顆粒重悬於 2 mL 冷 ReNcell® 分化培養基中，渦旋 10 秒。將 15 mL 管置於冰上。
- 取一小部分懸浮細胞，以 1:10 稀釋以進行細胞計數（10uL 懸浮液：90uL 分化培養基）。
- 使用細胞計數器玻片計數細胞；如有需要，稀釋細胞（最佳濃度為 ~2 × 107 cells per mL，然後在接下來的步驟中以 1:1 的比例加入 Matrigel 基質）。
註：此階段最好能達到較高的細胞濃度。我們發現每毫升 1 × 107 的細胞（以 1:1 的比例加入 Matrigel 基質後，見步驟 34）在生化分析中顯示出強大的 APP 和 p-tau 積聚。
人 ReNcell® 的 3D 培養細胞播種 VM NSCs
- 按照選項 A 製作厚層 3D 培養物，或按照選項 B 製作薄層 3D 培養物。
注意：為了及早實現APP聚集，培養大量細胞是很重要的。在 Matrigel 基質混合物中，所需的細胞數量是每毫升 1 × 107 個。因此，在此階段需要培養足夠的細胞。
(A)厚層 3D 培養（3-4-mm 厚）
- 在冰上向細胞懸浮液中加入冷 Matrigel 基質（1:1（vol/vol）稀釋）。確保在轉移 Matrigel 基質之前，先透過來回移動冷的分化培養基來冷卻移液器吸頭。
- 渦旋混合物 30 秒。
- 使用預先冷卻的移液管將 300 μL 的 Matrigel/細胞懸浮混合物分佈到 24 孔板的每個組織培養插板中。
- 將預溫的（37 °C水浴中）ReNcell分化培養基加入到平板中（1 mL：500 μL加入到插入孔中，500 μL加入到周圍的孔中）並放回培養箱中。
- 每 3-4 d 更换一半体积的培养基；开始时，根据培养基的颜色，可能需要每 2d 更换一次培养基。切勿讓已分化的細胞在沒有培養基的情況下乾燥。
- 根據實驗情況，分化 3D 鍍膜細胞 4-17 周。藥物處理應在端點分析前的最後 2 周進行。
注意：由於在光學顯微鏡下不易監測厚層培養物，因此必須進行常規的 LDH 釋放檢測，以檢查培養物的狀態。此外，強烈建議使用相同的 Matrigel/細胞混合物建立薄層 3D 培養，以監控培養物的品質。
(B) 薄層 3D 培養 (100-300-mm 厚)
- 在冰上將冷的 Matrigel 基質加入細胞懸浮液中 (1:1 (vol/vol) 稀釋)。在轉移 Matrigel 基質之前，請務必先透過來回移動冷的分化培養基來冷卻移液器吸頭。對於 96 孔板薄層培養，可加入五倍的冷 ReNcell 分化培養基（最終稀釋度為 1:11）進一步稀釋 1:1 Matrigel 基質/細胞混合物，並旋轉 30 秒。同樣的稀釋率可用於 8 孔/16 孔腔蓋玻璃玻片或 MatTek™ 玻璃底皿中的薄層 3D 培養。
- 使用預冷移液管在 96 孔板的每孔中加入 100 μL Matrigel 基質/細胞懸浮混合物。如果需要更厚的 3D 培養，每孔使用兩滴（使用多道移液管 160 μL）。八孔室蓋玻片建議使用 200 μL，玻璃底皿建議使用 300 μL。
- 在 37 °C 的 CO2 培養箱中將平板培養過夜。
- 第二天，在 96 孔板的每個孔中加入兩滴預先溫過的 ReNcell®分化培養基（使用多道移液管加入 160 μL），八孔室蓋玻片加入 200 μL，玻璃底皿加入 300 μL。
- 每 3-4d 更换一半体积的培养基；开始时，根据培养基的颜色，可能需要每 2 次更换培养基。切勿讓已分化的細胞在沒有培養基的情況下乾燥。
註：ReNcell®在薄層三維培養物中的分化可以用光學顯微鏡和螢光顯微鏡密切監測。部分培養物可於 2-4 週時以 4% 多聚甲醛固定，並使用 Anti-β-Amyloid antibody (MAB348) 和 Anti-Phospho Tau (AB9668) 透過免疫螢光染色或免疫組織化學檢測神經標誌物的表達。
結果
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圖 3. A)抗β-淀粉樣蛋白抗體染色(MAB348)在阿爾茨海默病細胞上的染色。B)阿爾茨海默病細胞的抗磷酸化 Tau 染色（AB9668）。免疫活性顯然不是核的，而且是跟隨神經元軸突的長度。
圖 4.利用剛果紅染色法分析三維培養中的淀粉樣蛋白聚集。 克隆 FAD ReNcell NSCs（SCC008FAD2、SCC008FAD3、SCC008FAD5）經 3D 分化 7 周後用溫和去污劑提取。將團粒（不溶性）部分在 PBS 中重懸，裝入玻璃片中固定，並用 1%剛果紅溶液（HT60）染色。
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附加細胞株 | |
|---|---|
| 產品編號 | 產品說明 |
| Alzheimer's® In A Dish HReN-mGAP Clone A4H11 NSC Line | |
Alzheimer's® In A Dish ReN-mGAP Clone D4 NSC Line | |
Alzheimer's® In A Dish ReN-G2 Clone B2 NSC Line | |
Alzheimer's® In A Dish ReN-GA2 Clone 3C1 NSC Line | |
Alzheimer's® In A Dish ReN-GA2 Clone A5 NSC Line | |
| Alzheimer's® In A Dish ReN-mAP3 Clone E6F4 P7 NSC Line | |
Alzheimer's® In A Dish ReN-mGAP Clone H10 NSC Line | |
參考資料
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