Przewodnik po dysocjacji tkanek: Typy enzymów kolagenazy, dyspazy i liberazy

Ogólne informacje o naszych enzymach do dysocjacji tkanek

• Opis naszych enzymów kolagenazy
• Produkty zawierające enzymy kolagenazy
• Kolagenaza i Liberaza^®./a>
• Collagenase and Liberase^® Enzymy firmy Roche
• Collagenase Assays
• Collagenase Tissue Digestion/Dissocation Troubleshooting and References

Kolagenazy to enzymy, które rozkładają natywny kolagen utrzymujący tkanki zwierzęce razem i są wytwarzane przez różne mikroorganizmy i wiele różnych komórek zwierzęcych¹. Najsilniejszą kolagenazą jest "surowa" kolagenaza wydzielana przez bakterie beztlenowe Clostridium histolyticum. Pierwotnie przyjęliśmy proces fermentacji i oczyszczania z 1953 r. opisany przez MacLennana, Mandla i Howesa², ale ostatecznie udoskonaliliśmy go w celu uzyskania produktów o wyższej aktywności. "Surowa" kolagenaza odnosi się do faktu, że materiał jest mieszaniną kilku różnych enzymów oprócz kolagenazy, które działają razem w celu rozbicia tkanki. Obecnie wiadomo, że obecne są dwie formy enzymu kolagenazy^3,4. Z kilkoma wyjątkami różne komercyjne kolagenazy są wytwarzane z C. histolyticum lub są rekombinowanymi wersjami, w których Escherichia coli wyraża gen sklonowany z C. histolyticum.

Opis naszych enzymów kolagenazy

Różne produkty kolagenazy w poniższych tabelach zostały opracowane, ponieważ każdy z nich trawi niektóre rodzaje tkanek (mięśnie, trzustkę, serce, tkankę tłuszczową) lepiej niż inne. Oprócz spełnienia specyfikacji aktywności enzymu, każda partia naszych produktów kolagenazy musi przejść testy trawienia z różnymi tkankami szczurów. Produkty, które są również opisane jako "testowane na hodowlach komórkowych" przeszły dodatkowe testy na liniach komórkowych ssaków w celu sprawdzenia, czy nie są cytotoksyczne.

Filtrowane sterylnie (0.2 mm) przygotowane z niektórych bardziej popularnych produktów kolagenazy są również wymienione poniżej.

Nasze oczyszczone produkty kolagenazy mają tylko śladowe ilości kazeinazy (proteolitycznej) lub aktywności klostrypazy. Oczyszczona kolagenaza typu VII jest również oferowana w wersjach testowanych w hodowli komórkowej i sterylnie filtrowanych.

Produkty enzymatyczne kolagenazy - kolagenaza surowa, oczyszczona chromatograficznie, kolagenaza z inhibitorem aktywności proteolitycznej i mieszanki

Kolagenaza surowa do użytku ogólnego

a, b FALGPA i jednostki trawienne kolagenazy (CDU) podane w jednostkach na mg/stałe

Produkt	Komentarze	FALGPAa	CDUb
C0130	Do użytku ogólnego	0.25 - 1.0	> 125
C1639, Typ I-S	Filtrowana sterylnie wersja C0130	0.25 - 1.0	> 125
C9891, Typ IA	Druga wersja Typu I do ogólnego użytku	0.5 - 2.0	> 125
C2674, Typ IA	Testowana na kulturach komórkowych wersja C9891	0.5 - 2.0	> 125
C5894, Typ IA-S	Filtrowana sterylnie wersja C9891	0.5 - 2.0	> 125
C9722, typ IA-S	Testowana w hodowli komórkowej i sterylnie filtrowana wersja C9891	0.5 - 2.0	> 125

Surowa kolagenaza, testowana pod kątem użycia

a, b FALGPA i jednostki trawienne kolagenazy (CDU) podane w jednostkach na mg/stałe

Produkt	Komentarze	FALGPA a	CDU b
C6885, typ II	Testowany jako odpowiedni do trawienia i uwalniania komórek tłuszczowych (adipose) z nieuszkodzonymi receptorami na powierzchni komórek dla insuliny5,6	0.5 - 2.0	> 125
C1764, Typ II-S	Filtrowana sterylnie wersja C6885	0.5 - 2.0	> 125
C5138., typ IV	Testowany jako odpowiedni do trawienia i uwalniania żywych komórek wątroby szczura (hepatocytów)7	0.5 - 2.0	> 125
C1889, Typ IV-S	Filtrowana sterylnie wersja C5138	0.5 - 2.0	> 125
C2139, Typ VIII	Przeszedł zarówno test tkanki tłuszczowej (patrz C6885)5, 6 i test tkanki wątrobowej (patrz C5138)7	0.5 - 2.0	> 125
C9263, Typ V	Testowany jako odpowiedni do trawienia i uwalniania wysepek Langerhansa (komórek produkujących insulinę) z trzustki szczura8,9	1.0 - 3.0	> 125
C2014, Typ V-S	Filtrowana sterylnie wersja C9263	1.0 - 3.0	> 125
C7657, Typ XI	Ma najwyższą aktywność kolagenazy - przetestowany jako odpowiedni do trawienia i uwalniania wysepek Langerhansa (komórek produkujących insulinę) z trzustki szczura8,9	2.0 - 5.0	> 1,200
C9407, Typ XI	Testowana na kulturach komórkowych wersja C7657	2.0 - 5.0	> 1,200
C4785, Typ XI-S	Filtrowana sterylnie wersja C7657	2.0 - 5.0	> 1,200
C9697, Typ XI-S	Testowana na hodowlach komórkowych i sterylnie filtrowana wersja C7657	2.0 - 5.0	> 1,200

Chromatograficznie oczyszczona kolagenaza

a, b FALGPA i jednostki trawienne kolagenazy (CDU) podane w jednostkach na mg/stałe

Produkt	Komentarze	FALGPAa	CDUb
C0255, typ III	Purified collagenase that has trace amounts of protease activity	4 - 12	≥ 250
C0773, Typ VII	Purified collagenase substantially free of protease and Clostripain	4 - 12	1,000 - 3,000
C2799, typ VII	Testowana w hodowli komórkowej wersja C0773	4 - 12	1,000 - 3,000
C2399, Typ VII-S	Filtrowana sterylnie wersja C0773	4 - 12	1,000 - 3,000
C9572, Typ VII-S	Testowana na hodowlach komórkowych i sterylnie filtrowana wersja C0773	4 - 12	1,000 - 3,000

Surowa kolagenaza z inhibitorem aktywności proteolitycznej

a, b FALGPA i jednostki trawienne kolagenazy (CDU) podane w jednostkach na mg/stałe

Produkt	Komentarze	FALGPA a	CDU b
C6079, Typ S	Blend kolagenazy typu XI z inhibitorem proteazy tryptycznej. Testowany jako odpowiedni do trawienia i uwalniania wysepek Langerhansa (komórek produkujących insulinę) z trzustki szczura8, 9	2 - 5	Minimum 1,000

Collagenase Blends™

Produkty te zostały opracowane w celu zapewnienia większej powtarzalności trawienia kolagenazy w poszczególnych partiach. Proporcja oczyszczonej kolagenazy (mieszanka F) do oczyszczonej obojętnej proteazy klostridialnej jest zróżnicowana w mieszankach H i L, aby zapewnić badaczom szereg opcji trawienia.

a, c FALGPA i jednostki trawienne kolagenazy (CDU) podane w jednostkach na mg/stałe

Produkt	Komentarze	FALGPAa	Proteasec
C7926, Blend F	Przeważnie prawdziwe kolagenazy. Ponieważ aktywność FALGPA jest wysoka w porównaniu do CDU, zakłada się, że forma kolagenazy typu II jest w większości obecna	Min. 2.0	< 10
C8051, Blend H	Niewielka aktywność proteazy neutralnej połączona z aktywnością kolagenazy	Min. 1,0	Min. 10
C8176, Blend L<	Większa aktywność neutralnej proteazy jest zawarta w prawdziwej kolagenazie	< 1.0	Min. 40

Collagenase and Liberase^® Enzymes from Roche

Enzymy kolagenazy firmy Roche są intuicyjnie zaprojektowane i zaufane, aby zapewnić stałą wydajność i powtarzalne wyniki w rutynowych i krytycznych zastosowaniach. Kolagenaza nadaje się do przygotowywania komórek z wielu rodzajów tkanek, takich jak hepatocyty, adipocyty, wysepki trzustkowe, komórki nabłonkowe, komórki mięśniowe i komórki śródbłonka. Jednak przydatność każdej partii enzymu do przerwania tkanki powinna być określona empirycznie. Dodatkowo, nasza technologia enzymatyczna Liberase^® łączy wysoce oczyszczone enzymy kolagenazy I i II z Dispase^® lub Thermolysin, aby ułatwić dysocjację szerokiego zakresu typów tkanek.

Przewodnik po aplikacji Liberase Research Grade

*Dane na podstawie publikacji

Tissue Type	TL	TM	TH	DL	DH
Wątroba		+			+
Nerka		+		++
Skóra			+	++
Serce		+	+		+
Trzustka (wysepki)	++			+
Węzeł chłonny*	++	+
Śledziona*	++
Płuca*	++	++
Tkanka jajnika*<		++
Tkanka tłuszczowa*		++
Cornea*		++

Enzymy dyspazy

Wraz z enzymami dostępnymi w Roche, jesteśmy zaangażowani w dostarczanie odczynników do dysocjacji tkanek, które są wysoce oczyszczone i niezawodne dla konkretnych potrzeb aplikacyjnych. Delikatny enzym, który nie uszkadza błon komórkowych, dyspaza jest odpowiednia do oddzielania różnych tkanek i komórek hodowanych in vitro oraz do zapobiegania zlepianiu się komórek w hodowlach zawiesinowych.

Collagenase Assays

Formy typu I i typu II oczyszczonych enzymów kolagenazy różnią się specyficznością i względną aktywnością na natywnym kolagenie i syntetycznych substratach. Te dwie kolagenazy można rozróżnić głównie na podstawie ich preferencji dla jednego z dwóch różnych substratów stosowanych w naszych testach. Test Collagenase Digestive Unit (CDU)^10,11 mierzy głównie aktywność kolagenazy I, która rozszczepia dwa z trzech łańcuchów helikalnych w długim, niezdenaturowanym białku kolagenu. Aktywność kolagenazy II jest mierzona zdolnością tego enzymu do cięcia krótkiego syntetycznego peptydu, N-[3-(2-furylo)akryloilo)]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA, patrz nr produktu. F5135), w drugim teście trawienia kolagenazy^12,13. Wykazano, że oczyszczone preparaty kolagenazy I lub II są mniej skuteczne w trawieniu różnych rodzajów kolagenu lub tkanek ssaków w porównaniu z mieszaniną obu form tego enzymu. Oczyszczona kolagenaza zawierająca tylko formy kolagenazy I i II tego enzymu jest mniej skuteczna w trawieniu tkanki niż cała surowa kolagenaza lub kombinacje oczyszczonej kolagenazy i różnych proteaz. Oczywiście połączenie prawdziwej kolagenazy i różnych natywnych proteaz, klostrypazy i aminopeptydaz, które wyewoluowały w przyrodzie, pomagają sobie nawzajem w trawieniu kolagenu w różnych tkankach zwierzęcych. Do trawienia tkanek surowe produkty kolagenazy zawsze były najbardziej skuteczne. Niektórzy badacze wypróbowali mieszaniny chromatograficznie oczyszczonej kolagenazy z proteazą, taką jak trypsyna lub subtylizyna, w celu trawienia tkanek.

Oprócz testów CDU i FALGPA na aktywność kolagenazy, testujemy każdą partię produktu pod kątem aktywności kazeinazy^14,15, klostrypainy i tryptazy, aby sprawdzić aktywność enzymów proteolitycznych w produktach kolagenazy. Test kazeinazowy jest najważniejszym z trzech testów do pomiaru aktywności proteolitycznej, która wspomaga trawienie tkanek zwierzęcych. Ponieważ klostripaina obecna w surowej kolagenazie musi zostać zredukowana (np. poprzez traktowanie ditiotreitolem), aby była aktywna, enzym ten prawdopodobnie w niewielkim stopniu przyczynia się do procesu dysocjacji tkanek w laboratorium. Jest on monitorowany, ponieważ niektórzy badacze donoszą, że Clostripain może być szkodliwy lub toksyczny.

Wiele produktów kolagenazy, które spełniają specyfikacje enzymatyczne, jest również testowanych z różnymi tkankami uzyskanymi od szczurów. Typ II (C6885, C1764) i typ VIII (C2139) są testowane pod kątem zdolności do uwalniania komórek tłuszczowych z najądrzy szczurów⁵. Komórki tłuszczowe są następnie badane pod kątem aktywności metabolicznej poprzez pomiar szybkości utleniania glukozy z dodatkiem i bez dodatku insuliny. Typ IV (C5138, C1889) i typ VIII (C2139) zostały przetestowane pod kątem zdolności do uwalniania żywych komórek z wątroby szczura⁷. Typ V (C9263, C2014), typ XI (C7657, C4785, C9407 i C9697) i typu S (C6079) muszą uwalniać nienaruszone wysepki Langerhansa z trzustki szczura, aby przejść test produktu⁸.

Rozwiązywanie problemów i referencje związane z trawieniem/dysocjacją tkanek za pomocą kolagenazy

Na podstawie naszych własnych badań i rozwoju oraz rozmów z klientami jasne jest, że sposób, w jaki dana tkanka jest wycinana i przygotowywana, ma znaczący wpływ na szybkość i skuteczność trawienia/dysocjacji tkanek za pomocą kolagenazy. Różnice w wieku dawców tkanek mogą być również głównym źródłem zmienności w czasie. Należy upewnić się, że jony wapnia są obecne w buforach trawiących w stężeniu 5 mM. Środki chelatujące EGTA i EDTA mogą poważnie hamować aktywność kolagenazy poprzez usuwanie jonów wapnia niezbędnych do stabilności i aktywności enzymu. β-merkaptoetanol¹⁶, cysteina¹⁶ i 8-hydroksychinolino-5-sulfonian¹⁶ to inne substancje hamujące. Nowa partia kolagenazy o wyższej aktywności specyficznej może powodować nadmierną śmierć komórek w ustalonym stężeniu. W takim przypadku należy użyć mniej kolagenazy i/lub dodać BSA lub surowicę (odpowiednio do 0,5% i 5-10%), aby ustabilizować komórki do dalszego trawienia.

Problem	Przyczyna	Rozwiązanie	Odniesienie
Strawianie jest słabe	Nieaktywne enzymy Niewystarczająca ilość Ca++ Niewystarczająca ilość enzymów	Przechowywać kolagenazę w suchym i chłodnym miejscu. Przechowywać roztwór kolagenazy w zamrożonych porcjach. Dodać 5 mM Ca++ do roztworu kolagenazy. Użyć więcej kolagenazy. Wypróbuj nasze mieszanki o większej aktywności proteazy.	6 7
DNA uwolnione z uszkodzonych komórek Nieodpowiednie gumy niebiałkowe	Zmniejszyć mieszanie Dodać DNAzę** Dobrze przepłukać tkankę przed trawieniem*** Nie używać Mg++ w roztworze trawiącym Dodać hialuronidazę z enzymami**	7 9 7 7 7 18
Komórki są zabijane	Nadmiar proteaz Zmiany pH Zbyt mało tlenu	Zmniejszenie ekspozycji na proteazy* Dodanie albuminy lub podgrzanej surowicy Użycie buforów (np.HEPES) zamiast HCO-3. Często sprawdzać i dostosowywać pH Napowietrzać roztwór trawiący (powietrzem lub O2) Trawić szybciej, stosując więcej enzymów	7 19
Wydajność komórek jest niska	Równowaga enzymatyczna Czynniki adhezyjne	Użyj więcej kolagenazy* Dołącz elastazę do kolagenazy** Perfuzuj najpierw tkankę, aby usunąć Ca++***	20 7
Wiele komórek jest uszkodzonych	Nadmiar proteazy< Uszkodzenia fizyczne	Używaj mniej proteazy* Dodaj albuminę lub podgrzaną surowicę Obchodź się z tkankami i komórkami bardzo delikatnie	21 7
Nowa partia nie działa	Odmiana partii	Używaj frakcjonowanych "mieszanek" kolagenazy (Nr produktu. C7926, C8051 lub C8176)*

* Oddzielnie przygotowane enzymy kolagenazy i proteazy w produktach "Blend" (nr. C7926, C8051 lub C8176) zapewniają powtarzalną kontrolę ilości każdego z nich.

** DNAza zostanie dezaktywowana przez nadmierne mieszanie, a dodane enzymy mogą zostać strawione przez neutralną proteazę obecną w kolagenazie.

*** Użyj EGTA (lub EDTA), aby usunąć Ca++ i wypłukać mikroorganizmy, a następnie przemyj tkankę buforem, aby usunąć środek chelatujący. Nie dodawać EGTA ani EDTA do roztworów enzymów!

Referencje

1. Harper E. 1980. Collagenases. Annu. Rev. Biochem.. 49(1):1063-1078. https://doi.org/10.1146/annurev.bi.49.070180.005215

2. MacLennan JD, Mandl I, Howes EL. 1953. BACTERIAL DIGESTION OF COLLAGEN 1. J. Clin. Invest.. 32(12):1317-1322. https://doi.org/10.1172/jci102860

3. Bond MD, Van Wart HE. 1984. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23(13):3085-3091. https://doi.org/10.1021/bi00308a036

4. Matsushita O, Jung C, Katayama S, Minami J, Takahashi Y, Okabe A. 1999. Gene Duplication and Multiplicity of Collagenases in Clostridium histolyticum. J. Bacteriol.. 181(3):923-933. https://doi.org/10.1128/jb.181.3.923-933.1999

5. Rodbell M. 1964. Metabolism of Isolated Fat Cells. Journal of Biological Chemistry. 239(2):375-380. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)51687-2

6. Fain JN. 1975. [53] Isolation of free brown and white fat cells.555-561. https://doi.org/10.1016/0076-6879(75)35184-7

7. Seglen PO. 1976. Chapter 4 Preparation of Isolated Rat Liver Cells.29-83. https://doi.org/10.1016/s0091-679x(08)61797-5

8. Lacy PE, Kostianovsky M. 1967. Method for the Isolation of Intact Islets of Langerhans from the Rat Pancreas. Diabetes. 16(1):35-39. https://doi.org/10.2337/diab.16.1.35

9. Buitrago A, Gylfe E, Henriksson C, Pertoft H. 1977. Rapid isolation of pancreatic islets from collagenase digested pancreas by sedimentation through percoll? at unit gravity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 79(3):823-828. https://doi.org/10.1016/0006-291x(77)91185-8

10. Moore S, Stein WH. 1948. PHOTOMETRIC NINHYDRIN METHOD FOR USE IN THE CHROMATOGRAPHY OF AMINO ACIDS. Journal of Biological Chemistry. 176(1):367-388. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)51034-6

11. “Enzymatic Assay of Collagenase. Collagen Digestion Assay”, our quality control test procedure..

12. Van Wart HE, Steinbrink D. 1981. A continuous spectrophotometric assay for Clostridium histolyticum collagenase. Analytical Biochemistry. 113(2):356-365. https://doi.org/10.1016/0003-2697(81)90089-0

13. “Enzymatic Assay of Collagenase Using FALGPA as the Substrate”, our quality control test procedure..

14. Anson M, Gen. Physiol. J. The Estimitation of Pepsin, Trypsin, Papain and Cathepsin with Hemoglobin. 22, 79 (1938).

15. “Enzymatic Assay of Caseinase (Collagenase Products)”, our quality control test procedure..

16. Seifter S, Gallop PM, Klein L, Meilman E. 1959. Studies on Collagen. Journal of Biological Chemistry. 234(2):285-293. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)70290-1

17. Berry MN, Friend DS. 1969. HIGH-YIELD PREPARATION OF ISOLATED RAT LIVER PARENCHYMAL CELLS. 43(3):506-520. https://doi.org/10.1083/jcb.43.3.506

18. Bellemann P, Gebhardt R, Mecke D. 1977. An improved method for the isolation of hepatocytes from liver slices. Analytical Biochemistry. 81(2):408-415. https://doi.org/10.1016/0003-2697(77)90711-4

19. Ives HE, Schultz GS, Galardy RE, Jamieson JD. 1978. Preparation of functional smooth muscle cells from the rabbit aorta.. 148(5):1400-1413. https://doi.org/10.1084/jem.148.5.1400

20. Fain JN, Loken SC. 1969. Response of Trypsin-treated Brown and White Fat Cells to Hormones. Journal of Biological Chemistry. 244(13):3500-3506. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)83400-7

21. Berry, M, Edwards, Aa, Barritt, G. 1991. Isolated Hepatocytes; Preparation, Properties and Applications. Elsevier. .