Przegląd glikanów N-linkowych

 

N-linked glycosylation Wprowadzenie

N-linked glycosylation, modification, and degradation are involved in a wide variety of processes in all organisms from archaea to eukaryota. Jest to najczęstsza kowalencyjna modyfikacja białek w komórkach eukariotycznych. Żadna inna potranslacyjna modyfikacja białek nie jest tak złożona chemicznie i nie pełni tak wielu różnorodnych funkcji.

Struktury

Wszystkie N-linkowane glikany oparte są na wspólnym rdzeniu pentasacharydowym, Man₃GlcNAc₂  (Rysunek 1). Dalsze przetwarzanie w golgim skutkuje trzema głównymi klasami glikanów N-linkowych:

• Wysoka mannoza
• Hybryda
• Kompleks

Rysunek 1. Podstawowa struktura dla wszystkich glikanów N-linkowych.

Glikany o wysokiej zawartości mannozy zawierają niepodstawione końcowe cukry mannozowe (Rysunek 2). Glikany te zazwyczaj zawierają od pięciu do dziewięciu reszt mannozy przyłączonych do rdzenia chitobiozy (GlcNAc₂). Skróty nazw wskazują na całkowitą liczbę reszt mannozowych w strukturze.

Rysunek 2. Przykłady glikanów o wysokiej zawartości mannozy Man-5 (góra) i Man-9 (dół).

Glikany hybrydowe charakteryzują się tym, że zawierają zarówno niepodstawione końcowe reszty mannozy (obecne w glikanach o wysokiej zawartości mannozy), jak i podstawione reszty mannozy z wiązaniem N-acetyloglukozaminy (obecne w złożonych glikanach) (Rysunek 3). Te sekwencje GlcNAc dodane do rdzenia glikanu związanego z N w hybrydowych i złożonych N-glikanach nazywane są "antenami". Najwyższa struktura pokazana na Rysunku 3 to biantenowy glikan z dwiema gałęziami GlcNAc połączonymi z rdzeniem. Dolna struktura to trójantenowy glikan z trzema gałęziami GlcNAc.

Rysunek 3. Przykłady glikanów hybrydowych dwuantenowych (u góry) i trójantenowych (u dołu).

Złożone glikany N-linkowe różnią się od glikanów o wysokiej zawartości mannozy i glikanów hybrydowych tym, że mają dodane reszty GlcNAc zarówno w miejscach α-3, jak i α-6 mannozy (Rysunek 4). W przeciwieństwie do glikanów o wysokiej zawartości mannozy, złożone glikany nie zawierają reszt mannozy poza strukturą rdzenia. Dodatkowe monosacharydy mogą występować w powtarzających się jednostkach laktozaminy (GlcNAc-β(1→4)Gal). Złożone glikany występują w formach dwu-, trzy- i czteroantenowych i stanowią większość N-glikanów wydzielanych na powierzchni komórek. Złożone glikany są zwykle zakończone resztami kwasu sialowego. Możliwe są również dodatkowe modyfikacje, takie jak dodanie dwuskładnikowego GlcNAc w rdzeniu mannozylowym (jak wskazano na Rysunku 4) i/lub reszty fukozylowej na najbardziej wewnętrznym GlcNAc.

Rysunek 4. Przykład tetraantenowego złożonego glikanu, który zawiera końcowe reszty kwasu sialowego, dwusieczny GlcNAc na rdzeniu pentasacharydowym i fukozylację na rdzeniu GlcNAc.

Biosynteza i degradacja

Glikozylacja białek glikanami N-związanymi jest w rzeczywistości zdarzeniem ko-translacyjnym, zachodzącym podczas syntezy białek. N-wiązana glikozylacja zachodzi w sekwencji konsensusowej Asn-X-Ser/Thr, gdzie glikan przyłącza się do grupy aminowej asparaginy, a X reprezentuje dowolny aminokwas z wyjątkiem proliny. Glikozylacja występuje najczęściej, gdy ta sekwencja konsensusowa występuje w pętli wewnątrz peptydu.

Półprodukty oligosacharydowe przeznaczone do przyłączenia białka są syntetyzowane przez serię transferaz po cytoplazmatycznej stronie endoplazmatycznego rektulum (ER), podczas gdy są połączone z zasadą fosforanu dolicholu (P-Dol). Po dodaniu cząsteczek mannozy i N-acetylo-D-glukozaminy, zwykle przy użyciu GDP-Man i UDP-GlcNAc jako donorów glikanu, ostatecznym konstruktem przed przemieszczeniem się z cytoplazmatycznej strony ER jest Man₅GlcNAc₂-P-Dol (Rysunek 5).

Ten prekursor dolicholu z przyłączonym glikanem jest przesuwany do światła ER ("odwracany") w celu dalszej modyfikacji enzymatycznej. Przetwarzanie obejmuje przycinanie reszt glukozy i mannozy przez glikozydazy i dodawanie nowych reszt przez glikozylotransferazy w ER i, w dużej mierze, w Golgim. W Golgim N-glikany o wysokiej zawartości mannozy mogą być przekształcane w różne złożone i hybrydowe formy, które są unikalne dla kręgowców. Ukończony oligosacharyd jest następnie przenoszony z prekursora dolicholu do Asn białka docelowego przez oligosacharylotransferazę (OST).

Rysunek 5. Ogólny proces budowy glikanu N-wiązanego w ER. Prekursor glikanu jest montowany na bazie fosforanu dolicholu w cytoplazmie ER (A). Po przełączeniu glikanu na stronę światła (B), glikan ma dodatkowe cukry dodawane i usuwane (przycinane) przed przyłączeniem do białka (C), gdzie następuje dodatkowe przetwarzanie (D).

Odcięte glikany o wysokiej zawartości mannozy służą jako substraty w Golgim, gdzie następuje dodatkowa modyfikacja i dywersyfikacja. Struktury o wysokiej zawartości mannozy są przycinane przez działanie mannozydaz, usuwając przedłużenia mannozy i udostępniając glikan do konwersji do hybrydowych i złożonych glikanów przez późniejsze dodanie cukrów GlcNAc ("anteny") przez działanie N-acetyloglukozylotransferaz. Gen ssaków Mgat1 koduje enzym N-acetyloglukozylotransferazę-I (GlcNAcT-I), który jest odpowiedzialny za dodanie jednego GlcNAc w wiązaniu β(1→2). Następnie zmodyfikowany glikan staje się substratem dla α-mannozydazy II, która usuwa reszty α(1→3) i α(1→6) reszt mannozy i skutkuje strukturą molekularną, która podlega donacji grupy glukozylowej przez GlcNAcT-II (N-acetyloglukozylotransferazę-II), kodowaną przez gen Mgat2 . Kataliza przez GlcNAcT-II przekształca hybrydowe glikany w formy złożone poprzez przyłączenie dodatkowych ugrupowań GlcNAc do struktury hybrydowej.

Fukozylacja w rdzeniu reszty GlcNAc po modyfikacji GlcNAcT-I zarówno w hybrydowej, jak i złożonej syntezie N-linków jest również powszechnym zjawiskiem. U kręgowców fukoza jest dodawana w wiązaniu α(1→6), podczas gdy u roślin i bezkręgowców fukoza jest dodawana w wiązaniu α(1→3).

Zahamowanie lub eliminacja glikozylacji w badaniach N-wiązanych glikanów może być spowodowana przez szereg związków. N-glikozylacja jest silnie hamowana w obecności kompaktyny, koenzymu Q lub egzogennego cholesterolu. Leczenie tunicamycyną całkowicie blokuje glikozylację, ponieważ tunicamycyna hamuje C-1-fosfotransferazę GlcNAc, enzym, który jest krytyczny w tworzeniu prekursora dolicholu.

α-mannozydaza, β-mannozydaza, sialidaza i α-fukozydaza są głównymi egzoglikozydazami zaangażowanymi w przycinanie i degradację N-łączonych glikanów. Komórki owadów wyrażają N-acetyloglukozminidazę, która rozszczepia końcowe reszty GlcNAc z glikanów N-łańcuchowych.

Funkcje

Podczas rozwoju struktury pośrednie glikoproteiny pełnią określone funkcje. We wczesnych fazach ewolucji glikoprotein, różne struktury oligosacharydów rdzeniowych są niezbędne do prawidłowego fałdowania białek i orientacji grup funkcjonalnych. Nieprawidłowo sfałdowane białka są albo reglikozylowane i ponownie fałdowane, albo deglikozylowane i degradowane. W późniejszych fazach cząsteczka oligosacharydu jest wymagana do transportu wewnątrzkomórkowego i ukierunkowania glikoproteiny w retikulum endoplazmatycznym, kompleksie Golgiego i sieci trans-Golgiego. W końcowej fazie glikan związany z N ulega rozległej modyfikacji w kompleksie Golgiego, w wyniku czego powstaje dojrzała glikoproteina.

Cząsteczka białka i przyłączone hydrofilowe glikany związane z N są względnie niezależne, mimo że są kowalencyjnie połączone, tj. glikany mogą być modyfikowane bez znaczącego wpływu na strukturę i funkcję białka. Białka mogą zawierać wiele miejsc glikozylacji, które są modyfikowane dowolną z trzech klas N-związanych glikanów. Stwierdzono, że kręgowce posiadają zróżnicowany zestaw złożonych i hybrydowych glikoprotein ze względu na szeroką gamę glikozydaz i glikozylotransferaz zakodowanych w genomie. Podczas gdy te trzy klasy glikoprotein z wiązaniami N są również obecne u niższych organizmów, istnieje mniejsza różnorodność struktury niż w glikoproteinach kręgowców.

Oprócz tego, że konkretna glikoproteina może zawierać wiele struktur glikanu, różne cząsteczki tej samej glikoproteiny mogą mieć różne struktury glikanu przyłączone do identycznego miejsca podstawienia. Modyfikacje w strukturach glikanowych zapewniają cechy identyfikacyjne różnym typom komórek i temu samemu typowi komórek na etapach rozwoju, różnicowania, transformacji, konserwacji i starzenia. Ta zmienność w glikozylacji białek jest znana jako mikroheterogenność i przyczynia się do trudności w identyfikacji i izolacji określonych glikoprotein.

Wrodzone zaburzenia glikozylacji (CDG) to seria chorób związanych z błędami metabolizmu spowodowanymi niedoborami enzymów. Większość zidentyfikowanych CDG wynika z niepowodzeń w biosyntezie lub degradacji N-glikanów z powodu braku jednego z enzymów zaangażowanych w N-glikozylację, głównie egzoglikozydowych enzymów α-mannozydazy, β-mannozydazy, sialidazy lub α-fukozydazy.